巴尔通体分离培养及生物学特性研究

作者：杨发莲白鹤鸣杨慧张青作者单位：云南省地方病防治所,云南大理671000.

【摘要】研究巴尔通体的分离培养及生物学特性。方法采用含5%去纤维兔血脑心浸液琼脂培基对收集自云南省的16个县（市）的913份鼠类血液进行巴尔通体分离培养，对疑似菌落用巴尔通体属特异性引物进行聚合酶链反应（PCR）及进行枸橼酸合酶基因（gltA）的379bp片断扩增，从电泳图中出现目标带的阳性菌中随机选出菌株进行电镜检测，同时将其gltA扩增产物行已序列测定并与已知菌株进行比较。结果从913份鼠类血液中分离到巴尔通体251份，分离率为27.5%（251/913）。阳性菌落长出时间最早为3d，菌落形态随培养时间延长而改变且特点多样;电镜扫描见多个菌缠绕成团,菌体密集,透射见菌细胞呈短杆状、菌壁较厚。核苷酸序列及相似性比较发现家鼠中巴尔通体有3个基因型。结论分离的巴尔通体种类多、生长特性不一、形态多样，呈高度流行及基因型的多样性，一些不明原因的疾病可能与之感染有关。

【关键词】巴尔通体分离培养生物学特性

　　CultureandisolationofBartonellaandanalysisofitsbiologicalcharacteristics.

　　YANGFa-lian,BAIHe-ming,YANGHui,etal.

　　（YunnanProvincialInstituteofEndemicDiseases,Dali671000,Yunnan,P.R.China）　　Abstract：ObjectiveTocultureandisolateofBartonellaandanalysisofitsbiologicalcharacteristics.MethodsBartonellastrainswereisolatedfrom913ratbloodsamplescollectedfrom16countiesinYunnanProvinceandinoculatedintomacconkeyagarwith5%non-fiberrabbitbloodbrainheartinfusionbroth,thenculturedandisolatedat35℃in5%CO2chamber,stainedwithGramstaininigandexaminedundermicroscopetoobservedtheircharacteristics.ThesuspectedbacteriacolonieswereamplifiedbyPCRwithspecificBartonellaintroducertoamplifyspecificgenefragment（379bpofgltAgene）,iftheobjectivebandappearsonelectrophoresischartitcanbejudgedthatthebacteriawerethepositivestrains.TheultrastructureofBartonellafromanypositivestrainwasobservedwithelectronmicroscopy,andthe379bpfragmentofgltAgenewassequencedandcomparedwithotherBartonellastrains.Results251Bartonellastrainswereisolatedfrom913ratbloodsampleswiththeisolationrateof27.5%.Theearliestgrowingperiodofpositivecolonieswas3days.Themorphologicalchangesofpositivecolonywereobservedalongwiththeelongationofculturingperiodwithdiversityofcharacteristics.GroupsofBartonellawereseentwiningroundthroughscanningelectronmicroscopy.SmallcoccobacillusandthickermembraneofBartonellawerenoticedthroughtransmissionelectronmicroscopy.ThethreegenotypeswerefoundintheBartonellainYunnanbysequencialanalysis.ConclusionBartonellastrainsarediverse,anditsmorphologymaymetamorphoseassociatedwithitsbroadpathogenesistohuman.ThesefindingsdemonstratethatBartonellasppishighlypprevalentanditsgenotypeishighlydiverse.Thefindingsalsoindicatefurtherinvestigationsbecarriedoutonelucidateitsroleinthetransmissionofunknowninfection.　　Keywords：Bartonella;Isolation;Culture;Biologicalcharacteristics

　　巴尔通体（Bartonella）是一新发现的古老病原体，早在1905年，秘鲁医生AlbertoBarton在血液中发现人类巴尔通体病Oroya热的致病因子；1919年，Battistini、Naguchi等分离出该病原体；为纪念Barton将这种微生物命名为杆菌样巴尔通体（Bartonellabacilliformis）。长期以来，杆菌状巴尔通体被认为是巴尔通体属中唯一的一种病原体。直到20世纪90年代才引起人们关注。迄今已发现21种及3个亚种,其中有8个种与人类感染密切相关［1］。分别是五日热巴尔通体（B.quintana）、杆菌状巴尔通体（B.bacilliformis）、汉赛巴尔通体（B.henselae）、伊丽莎白巴尔通体（B.elizabethae）、格雷汉巴尔通体（B.grahamii）、B.clarilgeiae、Bwashoensis［2］和B.vinsoniiarupensis［3］,以及最近报道的B.koehlerar［4］。由巴尔通体感染引起的疾病谱比较复杂，主要有猫抓病、卡里翁氏病、心内膜炎、杆菌性血管瘤和慢性巴尔通体血症等。另外，巴尔通体有时还会引起视网膜炎、脑炎、肾小球肾炎和肺炎等，给人类健康带来巨大的威胁。在1997年第一届巴尔通体国际会议上，该病原被正式确认为人类新发现的致病菌而日益引起国内外学者的关注［5］。　　我国相关研究开展较晚,1999年10月云南省地方病防治所与美国疾病控制中心虫媒传染病部联合在云南鼠群中首次开展了调查，证实巴尔通体在云南普遍存在［6］。随后北京、山东、福建等地也分别开展了相关调查,先后均证实有巴尔通体感染存在。自1999年云南首次在鼠群发现巴尔通体,并对16个县（市）的黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠、斯氏家鼠、大绒鼠、齐氏姬鼠、中华姬鼠、大林姬鼠、小家鼠、锡金小鼠、灰麝5个属的11个鼠种中先后分离到巴尔通体一百多株［7～9］。其中近百株经巴尔通体gltA基因的379bp片断进行了序列测定,并提交基因库。序列分析表明总体可分为3个基因型。巴尔通体种类多，形态多样，培养过程复杂，其间形态多变，这可能与巴尔通体感染引起多种疾病有关［10］。因此,为加深认识,我们对巴尔通体分离培养及生物学特性。

　　1材料和方法

　　1.1鼠类全血标本采集采用布笼、电猫、挖洞、灌水驱逐等方法捕捉活鼠，用3%～5%的煤皂酚溶液消毒其皮肤，经股动脉取血（非抗凝血），于-196℃的液氮容器中备用。

　　1.2阳性对照菌株巴尔通体菌株YJ41,分离自云南盈江,经PCR及测序技术证实为巴尔通体。

　　1.3两性霉素购于美国生产的品名为amresco,每瓶原装为100mg，使用时加入灭菌水20ml，浓度为0.5%（5mg/ml）。

　　1.4培养基

　　1.4.1BHI液体培养基脑心浸液（BrainHeartInfusion）购于美国Becton,Dickinson公司。按3.7gBHI加入90ml蒸馏水的比例，充分混均，121℃15min高压灭菌后，再加入5mg/ml的两性霉素溶液10ml，两性霉素在BHI溶液中的最终浓度为0.05%（500μg/ml），制成BHI液体培养基，置4℃冰箱备用。

　　1.4.2BHI固体培养基按37gBHI和15g琼脂粉（购于上海化学试剂采购供应站分装厂，为日本进口分装），加入900ml蒸馏水的比例，充分混均，121℃15min高压灭菌，待温度降至40～50℃左右，加入100ml新鲜兔溶血（50ml已去纤维和脂肪后的兔心脏血加50ml灭菌水），制成5%的兔血心浸液琼脂培基，后分装于培养皿中，置37℃温箱中做48h的无菌试验，确认无污染置4℃冰箱备用。

　　1.5接种与保存用BHI液体培基将被检鼠全血1:4稀释（鼠全血0.25ml加BHI至1ml），后取100μl，接种于BHI固体培基中，置35℃含5%CO2的培养箱中培养，每天观察其生长情况并记录，最长达40d，对疑似巴尔通体菌落进行1～4次纯分后，收集纯菌培养物于含BHI液体培基和甘油各50%的冻存管中，冻存于-70℃冰箱。

　　1.6培养物检测

　　1.6.1菌落观察在初次分离培养后常需1～5wk才能长出白色、干燥的小菌落黏稠状圆形凸起，光滑或粗糙的菌落均作为疑似菌落，并作涂片革兰氏染色。

　　1.6.2PCR的检测鉴定挑取疑似菌落收集于含100μl去离子水（pＨ8.0）的1.5ml离心管中，混匀，100℃煮8min，10000r/min离心15min，上清液即为模板，制成模板后，-20℃保存备用。聚合酶链反应（PCR）采用的是具有巴尔通体属水平特异性的引物（BhCS781.p-BhCS1137.n,由上海生物工程研究所合成），上游引物BhCS781.p硷基序列为：5′-GGGGACCAGCTCATGGTGG-3′,下游引物BhCS1137.n硷基序列为：5′-AATGCAAAAAGAACAGTAAACA-3′，对枸橼酸合酶基因（gltA）的379bp片断进行扩增，电泳图中出现目标带即判断为阳性菌株。使用的扩增仪是PTC-150型DAN仪（MJResearch,Watertown,MA）。PCR反应体系总量为20μl：含PfuMasterMix17μl（北京天为时代科技有限公司），上下游引物各1μl，模板1μl。扩增程序为95℃2min,48℃30s,72℃30s,再按94℃30s,48℃30s,72℃30s行30个循环，72℃延伸5min结束。取6μlPCR扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶经80～100V40min电泳，设标准分子量（Marker,50bpLadder）,阴性对照（用去离子水代替模板）。使用一次性凝胶成像仪观察扩增带并照相。

　　1.7电镜观察收集经PCR证实是巴尔通体菌中随机选出的株菌（在培养基中的长出时间均为第3d）分别置于电镜固定液中,送至昆明医学院电镜室检测。

　　1.8PCR产物核酸序列测定及序列分析先后将选出菌株的gltA扩增产物送至上海生物工程研究所测序。从BankIt程序在线将序列提交GenBank。网上利用核酸序列比对程序BLAST（美国国家生物技术信息中心，www.ncbi.nlm.nih.gov）进行核酸序列同源性搜索，用CLUSTALX1.83进行多序列匹配比对，然后用PHYLIP3.62软件进行系统进化树的构建。

　　2.1巴尔通体分离培养情况以景东龙陵、盈江、南华为例见表1。阳性菌落长出时间最早为3d，与文献报道一致。最迟32d，多数为1～2周长出，占70.2%（33/47）。

　　表147份阳性菌落长出时间（略）

　　Table1Thegrowingtimeof47positivecolinies

　　2.1.1菌落形态观察接种后24h开始每天观察培养基1次，最初观察到微小（Φ＜1.0mm）的圆形凸起菌落，呈灰白色、略透明、边缘光滑或粗糙，菌落数多少不等，在10～1000cfu以上；培养时间延长,可以见到菌落中央呈现“凹陷”、菌落表面变粗糙，有些经接种环刮起后可见培养基生长处留下圆形小坑，是巴尔通体菌落向培养基中下陷生长造成，与Anderson的文献报道一致［11］；有些菌落不黏附或稍黏附于培基表面,与Michael的文献报道一致［12］；有些呈蜡状不易挑取，挑起后不易黏附在玻片上。传代培养后菌落生长较快，菌落较原代大，少数可达2mm，且有些呈菜花样生长（图1）。

　　图1传代75d呈菜花样生长的菌落（略）

　　Fig1Culture75day,largercolonywithanirregularedge

　　2.2染色镜检巴尔通体是一种革兰氏染色阴性杆菌，但在革兰氏染色下菌体细小，而且染色效果差，Gimenez染色菌体呈紫色、细小、微弯曲的杆菌（图2）。最佳方法是warthin-stany涂片银染色法。

　　图2Gimenez染色菌体呈紫色、细小、微弯曲的杆菌（略）

　　Fig2Purple,small,curvedbacilliformis

　　2.3电镜观察

　　2.3.1巴尔通体菌的扫描电镜超微结构绝大多数菌均缠绕成团,每个菌只探出个头（图3）。用超声波冲击后,有少量孤立的巴尔通体菌,似圆球形外围呈云雾状,中间凹陷（图4）。

　　图3巴尔通体的扫描电镜图（略）

　　Fig3Bartonellascanningelectronmicroscopy

　　图4巴尔通体的扫描电镜图（略）

　　Fig4Bartonellascanningelectronmicroscopy

　　2.3.2巴尔通体菌的透射电镜超微结构电镜下菌细胞呈短杆状、菌壁较厚（图5）。

　　图5巴尔通体的透射电镜图（×80000）（略）

　　Fig5Bartonellatransmissionelectronmicroscopy

　　2.4PCR扩增结果用具有巴尔通体属水平特异性引物BhCS781.p-BhCS1137.n扩增，出现目标带（约为380bp），（图6）。

　　图6PCR扩增产物1.5%琼脂糖电泳图（略）

　　Fig6IdentificationofBartonellabyPCR

　　1为阳性对照;2为空白对照;3～10为目标带;M为DNA分子量标准。

　　2.5核苷酸序列及相似性比较目前发现家鼠中巴尔通体有3个基因型（B.elizabethae;B.tribocorumandB.Yunnanensis）。以澜沧所测5株菌序列为例，构建系统进化树（图7）。

　　图7澜沧5株菌gltA序列以及数据库中参比序列构建的系统发育树（略）

　　Fig7PhylogeneticrelationshipbetweenSequencesAnalysisofgltAinLanCang5BartonellastrainsandotherBartonellainGenBankcompared