白喉诊断标准及处理原则――附录C

　　血清学诊断方法

　　C1间接血凝法测定白喉抗体

　　C1.1原理

　　间接血凝法是利用红血球作为载体，并经过一定处理后，使蛋白质抗原吸附于红血球表面，此种血球称为致敏血球。然后用致敏血球来测定相应的微量抗体。当特异抗体存在时，发生抗原抗体结合，血球就出现凝集，为阳性反应。

　　C1.2材料

　　C1.2.1抗原

　　作致敏血球用。白喉类毒素含量为20～30Lf/mL以上。

　　C1.2.2标准抗毒素

　　每毫升含10个国际单位，用以测定致敏血球效价，用前须进行56℃，30min灭活。

　　C1.2.3血球

　　健康绵羊血球（血球保存液保存）。

　　C1.2.4试验溶液配制

　　C1.2.4.10.15mol/L磷酸盐和食盐溶液配制

　　C1.2.4.1.10.15mol/LNa2HPO4

　　Na2HPO4・12H2O（M・W＝358.16）53.72g

　　蒸馏水至1000mL

　　C1.2.4.1.20.15mol/LKH2PO4

　　KH2PO4（M・W＝136.09）20.41g

　　蒸馏水至1000mL

　　C1.2.4.1.30.15mol/LNaCl

　　NaC1（M.W＝58.45）8.77g

　　蒸馏水至1000mL

　　C1.2.4.2pH7.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）

　　0.15mol/LNa2HPO4　286mL

　　0.15mol/LKH2PO490mL

　　0.15mol/LNaCl376mL

　　配后测pH值，灭菌后备用。

　　C1.2.4.3pH6.4磷酸盐缓冲液（P.B.S）

　　0.15mol/LNa2HPO4100mL

　　0.15mol/LKH2PO4210mL

　　0.15mol/LNaCl310mL

　　配后测pH值，灭菌后备用。

　　C1.2.4.4pH8.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）

　　0.15mol/LNa2HPO4　97mL

　　0.15mol/LKH2PO43mL

　　配后测pH值，灭菌后备用。

　　C1.2.4.5戊二醛稀释液

　　pH8.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）100mL

　　0.15mol/LNaCl900mL

　　蒸馏水500mL

　　灭菌后放冷库备用。

　　C1.2.4.61％戊二醛溶液

　　25％戊二醛溶液4mL

　　戊二醛稀释液96mL

　　C1.2.4.71％鞣酸溶液

　　蒸馏水加至100mL

　　4℃避光保存可用一周，用前以生理盐水稀释至1∶20000。

　　C1.2.4.8血球保存液

　　葡萄糖2.05g

　　枸橼酸钠0.8g

　　NaCl0.42g

　　蒸馏水加至100mL

　　测pH，需用10％枸橼酸校正至pH6.15，于0.7kPa消毒20min。

　　C1.3致敏血球制备

　　C1.3.1血球采集与处理

　　选择健康绵羊静脉采血，注入血球保存液中（血球与保存液比例为1∶1），摇匀放冷库（2～8℃）48h，离心弃上清，用生理盐水洗涤血球三次，每次离心（2000～2500r/min）20～25min，弃上清得压积血球。

　　C1.3.2血球醛化

　　取上述压积血球1份，加入24份冷却的1％戊二醛溶液中，放2～6℃，固定时间大于等于30min，每5～6min摇动一次，离心（2000r/min，10min）弃上清，用生理盐水洗五次，再用蒸馏水洗五次，最后用生理盐水配成10％血球悬液，加入1∶10000硫柳汞防腐，放2～8℃冷库备用。

　　C1.3.3血球致敏

　　10％醛化血球悬液，白类用pH7.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）稀释至2.5％后进行鞣酸处理。

　　a）鞣酸处理

　　2.5％血球一份加1∶10000的鞣酸一份，混匀后放45℃或37℃水浴30min（每5～6min摇一次），然后用pH7.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）洗涤三次（2000～2500r/min，5～6min），最后用pH6.4磷酸盐缓冲液（P.B.S）配成2.5％鞣化血球悬液。

　　b）致敏

　　2.5％鞣化血球一份加精制白喉类毒素一份（25Lf/mL）加pH6.4磷酸盐缓冲液（P.B.S）三份置45℃或37℃水浴30min（须经常摇动），离心弃上清，用0.5％兔血清生理盐水洗涤二次，再用0.5％兔血清生理盐水配成2.5％血球悬液。

　　C1.3.4对照血球制备

　　2.5％鞣化血球一份加4份pH6.4磷酸盐缓冲液（P.B.S）置45℃或37℃水浴30min（须经常摇动），离心弃上清，用0.5％兔血清生理盐水洗涤血球二次，再用兔血清生理盐水配成2.5％对照血球悬液。

　　C1.4效价滴定

　　C1.4.1致敏血球、敏感度的测定

　　将标准白喉抗毒素用0.5％兔血清生理盐水先行稀释使每毫升含1个单位，然后再以倍比法进行一系列稀释，自1∶2～1∶4096，每个稀释度取一滴（0.025mL）加入血凝板孔中，再加入致敏血球一滴（0.025mL），摇匀放37℃2h，取出判读结果或放冰箱，次晨判读结果，以"＋＋"为凝集试验终点。白喉类毒素致敏血球的敏感度不能低于0.003906IU/mL.同时作两种对照：

　　a）不同稀释度抗血清加鞣化血球，以检查抗血清有无非特异性凝集；

　　b）0.5％兔血清生理盐水加致敏血球以检查血球有否自凝作用。以上两种对照皆为阴性试验才能成立，否则应重试。

　　C1.4.2待检血清处理

　　a）经56℃30min灭活。

　　b）醛化血球吸收。吸收方法：待检血清1份加50％醛化血球2份，放37℃1～2h，离心沉淀，吸取上清即为1∶2稀释的血清样品。

　　C1.4.3待检血清滴定

　　先在血凝板中每孔加入0.5％兔血清生理盐水一滴（0.025mL），再将待检血清用微量滴管滴入第一孔中（0.025mL），使与0.5％兔血清生理盐水混合，注意不要发生气泡，混匀血清后，每孔均取0.025mL，加入到第二孔中。混匀后自第二孔中吸出0.025mL到第三孔中，如此类推，最后一孔取出0.025mL弃掉。或用0.025mL的稀释棒自第2孔开始作系列稀释。用微量滴管吸取0.025mL0.5％致敏血球加到每个孔中，加时滴管勿碰到孔壁，以免沾有抗血清。然后摇匀，放37℃2h取出，放2～10℃冰箱内次日晨判读结果，以“＋＋”为凝集试验终点。每份待检血清可做三个稀释度抗血清加鞣酸血球的对照，稀释方法如前所述（即1∶2，1∶4，1∶8），以排除血清中非特异凝集。

　　C1.4.4结果计算

　　待检血清单位＝待检血清终点稀释度×标准血清终点稀释度所含单位数。例如标准白喉抗毒素（10IU/mL）终点稀释度为1∶2048，含有0.0048IU/mL，而待检血清终点稀释度为1∶8，于是其单位为0.038IU/mL。

　　C1.4.5结果判定标准

　　a）凝集的红血球均匀地铺在孔底形成一薄层为“＋＋＋＋”；

　　b）凝集的红血球基本同a），只是在此薄层的底部有一很弱红圈为“＋＋＋”；

　　c）凝集的红血球在孔底形成的薄层，同时中间可见一松散的红圈为“＋＋”；

　　d）凝集的红血球在孔底形成一圆圈，周围可见少量的红血球比对照圆圈稍大为“＋”；

　　e）血球在孔底形成紧密的圆圈成圆点为"－".影响血凝试验的准确性与敏感度因素很多，如用具的清洁，材料的标准化，操作的细致等。

　　C2酶联免疫吸附试验检测白喉毒素抗体

　　C2.1原理

　　利用包被在固相载体上白喉类毒素捕捉待检血清中相应抗毒素抗体，再用酶标记的抗人IgG抗体去掉反应（抗原－抗体－酶标记抗抗体），利用底物使酶显色而测知是否存在抗体。

　　C2.2材料

　　C2.2.1抗原

　　精制白喉类毒素1110Lf/mL。

　　C2.2.2结合物

　　羊抗人IgG酶标记抗体。

　　C2.2.3载体

　　1cm×4cm聚苯乙烯塑料管平底带盖。

　　C2.2.4底物

　　邻苯二胺。

　　C2.2.5参考血清

　　多份间接血凝法阳性高效价血清混合为阳性参考血清，多份阴性血清混合为阴性参考血清。

　　C2.2.6被检血清

　　白喉暴发流行区的病人和健康者。

　　C2.2.7测定仪

　　721型分光光度计。

　　C2.3方法及步骤

　　C2.3.1包被抗原量及被检血清最适稀释倍数的确定

　　用阳性及阴性参考血清与抗原作方阵式滴定，确定本试验包被抗原浓度为20μg/mL，被检血清最适起始稀释度为1∶40.

　　C2.3.2参考血清标准曲线绘制

　　阳性及阴性参考血清均从1∶40开始至10240二倍法稀释，反应结果用721型分光光度计测光密度OD值，γ＝492nm.本试验取三次测定结果的均值，以血清稀释度为横坐标，相对应的OD值为纵坐标，画曲线；然后用相关回归法确定OD值与血清稀释倍数相对应的标准曲线。阳性血清最高OD值为0.6，最低为0.1.因阳性和阴性血清呈明显差别的界限OD值为0.3处，故确定OD值大于等于0.3为阳性，其所对应的血清稀释度为1∶2560，即为一个单位。每份被检血清稀释度为1∶40，效价从标准曲线查出。经测算，两系数的P值皆小于0.01。

　　C2.3.3抗原包被

　　每管加已稀释好的抗原1.0mL，放4℃过夜，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）－吐温20洗涤三次，两次之间静止3min，

　　C2.3.4加被检血清1.0mL，置室温2h，再洗涤三次，方法同前。

　　C2.3.5加结合物（1∶8000）1.0mL，室温2h，洗涤同前。

　　C2.3.6加底物液（0.04％）1.0mL，室温下30min，加2mol/L硫酸0.015mL，如终止反应立即测OD值。

　　C3固相放射免疫法测白喉抗体

　　C3.1基本原理

　　固相放射免疫分析法（SPRIA）是应用双抗体法，以纯化的白喉类毒素吸附到固相载体上，加入特异性抗血清，载体上形成抗原－抗体复合物。然后再加入标有同位素的第二抗体，就形成抗原－抗体－抗抗体复合物，通过测定标记的第二抗体的放射性就可确定相应抗体的含量。

　　C3.2材料和方法

　　C3.2.1血清标本来源

　　人群白喉抗体水平检测对象，多为采集儿童血清标本。

　　C3.2.2精制白喉类毒素进一步纯化，经Sephadex　G－200过滤，测其浓度。

　　C3.2.3抗血清（标准品）

　　C3.2.4第二抗体及标化法

　　以马抗人IgG（经纯化）作为第二抗体，参照格林伍德（GreeWood）和亨特（Hunter）的高比度标化法进行放射碘化标化获得的（上标始）125（上标终）I－马抗人IgG，

　　C3.2.5固相载体

　　U型聚氯乙烯软塑料板。

　　C3.2.6缓冲液及填充液

　　a）缓冲液：PBST，即含0.05％吐温20的0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲盐水。

　　b）稀释液：PBST－BSA，即在缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白。

　　c）填充液：PBS－BSA，即在稀释液中减去吐温20。

　　C3.3操作方法

　　C3.3.1包被抗原，用碳酸缓冲液（pH9.6）将精制白喉类毒素稀释成5μg/mL，加入聚氯乙烯板各孔

　　100μL，置4℃冰箱过夜。

　　C3.3.2将抗原溶液甩净，用PBST洗5次，每1次静置1min左右，每孔加满填充液，将板放入湿盒内，37℃孵育1h，通过水泵将填充液吸净。