线粒体DNA点突变与肥厚型心肌病的关系

　　1　对象与方法

　　1.1　对象　HCM患者19例，诊断标准按照超声心动图室间隔或心室肌层≥13mm，除外引起继发性心肌肥厚的疾病如原发性高血压、心瓣膜病等。正常对照20名。对1例发现有mtDNA点突变的患者进行家系调查，其母亲、姐姐、次子分别于32岁、20岁、15岁猝死，长子健在，表型正常。

　　1.2　DNA提取　常规苯酚/氯仿法提取患者外周血淋巴细胞的基因组DNA（内含mtDNA）。

　　1.3　PCR扩增　采用Perkin/Cerus公司的热循环仪进行扩增，所用的1对引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成：引物序列为：L链（11641-11660）：5′-AGCCCTCGTACTAA-CAGCCA-3′；H链：（11981-11961）5′-GGAGTATAGGGCTG-TTGACTA-3′。扩增的这段特异的mtDNA由NADH脱氢酶亚单位4（ND4）所编码。

　　1.4　PCR-SSCP　采用非变性聚丙烯酰胺凝胶法检测。

　　1.5　PCR产物纯化　采用HighPurePCRProductpurification药盒（BoehringerMannheim）进行纯化。

　　1.6　序列分析　按常规双脱氧末端终止法进行测序，试剂为SilversequenceTMDNASequencingSystem（Promege公司）。

　　2　结果

　　2.1　PCR-SSCP结果分析　在HCM患者及正常对照个体外周血mtDNAcOIND4功能区，有1例患者的电泳带异常。对患者丈夫及长子的外周血进行筛查，发现患者与其长子呈现相同异常的电泳带，而丈夫电泳带与正常对照相同。

　　2.2　序列分析　患者及其长子均发现有两个位点的突变，分别位于mtDNAh链第11856、11892位点，T均突变为G，相应于L链A突变为C，分别导致天冬酰胺变为苏氨酸，谷氨酸变成丙氨酸。这两个位点的突变均为杂合型，即同一标本除存在突变的mtDNA外，在相应位置同时有正常的mtDNA。

　　3　讨论

　　mtDNA在氧化磷酸化（OXPHOS）的组装过程中起重要作用，OXPHOS由5种酶复合物组成（复合物I-V），其中13条与复合物相关的肽腱亚单位由mtDNA编码，mtDNA各基因排列紧密，几乎不含内含子序列，mtDNA上发生的任何突变都会累及到基因组中的重要功能区，从而影响OXPHOS过程，使ATP产生下降。心肌组织在能量不足的情况下，会发生退行性改变及代偿性肥厚增生等病理变化，从而导致疾病的发生。

　　HCM患者外周血mtDNAH链11856、11892位点T突变为G，相应于L链A突变为C，分别使ND4功能区第366位密码子AAC（天冬酰胺，Asn）变成ACC（苏氨酸，Thr），第378位密码子GAA（谷氨酸，Glu），变成GCA（丙氨酸，Ala）。天冬酰胺和谷氨酸在线虫→果蝇→海胆→非洲蟾蜍→鸡→鲸→牛→人基因种系进化中均为高度保守的［7］。

　　这两个位点的突变均位于mtDNA编码的复合物Ⅰ（COⅠ），COⅠ由ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND67个亚单位组成，它是电子传递链的起点，将线粒体外的电子传递到线粒体内，再经COⅢ、COⅣ传递给O2，通过OXPHOS机理驱动ATP的合成。因此，mtDNAnD4功能区11856、11892位点的碱基置换造成保守氨基酸的改变，必然导致COⅠ的功能缺陷，影响OXPHOS。本实验中mtDNA取自患者的外周血细胞，而研究表明，血细胞中的mtDNA突变数量低于成纤维细胞、肌肉细胞、上皮细胞等，即心肌细胞积累了更多的突变mtDNA。

　　mtDNA遗传学特征之一是母系遗传。对该患者进行家系探查，发现其母亲、姐姐、次子均在青壮年猝死。长子健在，经检查与患者存在相同的突变，而患者丈夫是正常的。家系分析显示，呈母系遗传倾向。我们推测患者的母亲、姐姐、次子亦为HCM患者，他们可能都存在mtDNA突变。

　　与核基因的传递方式不同，mtDNA除按母系遗传外，其突变与表型的关系常与mtDNA中突变型与野生型所占的比例有关，即突变型比例达到一定时发病，称为阈值效应。患者长子表型虽正常，但我们发现其mtDNA也存在上述两位点的突变，可能与突变型mtDNA比例未达到阈值有关。