健脾益肾颗粒

研究健脾益肾颗粒对胃癌术后复发转移及生存期的治疗

[关键词]胃癌;肿瘤复发;转移;生存期;健脾益肾方

胃癌患者根治性治疗之后多出现脾气亏虚。此外,患者虽然进行了根治性治疗,但体内仍残存着肿瘤细胞或突变基因,这些突变基因可能先天亏虚所致,日久肿瘤细胞仍会生长繁殖、转移、复发。肾为先天之本,脾胃为后天之本。中国中医科学院广安门医院肿瘤科针对肿瘤患者根治性治疗之后的特点制定了健脾益肾的中医治则。本实验在过去实验和临床研究基础上进一步采用具有淋巴道转移的小鼠前胃癌模型,在小鼠的爪垫皮下移植后,待原发瘤生长到一定大小时手术切除原发瘤,再应用健脾益肾方进行治疗,观察其对局部复发和远处转移的治疗作用及对生存期的影响。

1材料和方法

1.1实验动物

清洁级近交系6～7周615小鼠,雌雄各半,体质量18～24g,购自中国医学科学院药品鉴定所实验动物中心(动物许可证号SCXK京200020010号)。

1.2瘤株

小鼠前胃鳞癌细胞,中国医学科学院基础医学研究所病理室用甲基卞基亚硝胺灌胃诱发而成,移植率100%,传代品系615小鼠,为具有自发肺转移潜力的高转移细胞株,肺转移率为86%～90%,侵袭周围肌肉组织,中国医学科学院基础医学研究所病理室提供。

1.3药物

实验用健脾益肾方药为深棕色浸膏,生药浓度2.24g/g。由党参、白术、枸杞子、女贞子、补骨脂、菟丝子组成。制剂由中国中医科学院广安门医院制剂室提供。该方药物组成和剂量同北京长城制药厂生产的已上市的健脾益肾颗粒。阳性对照化疗药物为氟脲嘧啶注射液,10ml/支,0.25g/支,由上海旭东海普药业有限公司生产。批号:041a008。

1.4小鼠前胃鳞癌细胞细胞移植

从液氮中复苏小鼠前胃鳞癌细胞,接种于4只615小鼠右腋下,待局部肿瘤长至直径1～1.5cm大小时处死动物,8～12d后,无菌取出新鲜生长良好无坏死的肿瘤组织,用生理盐水洗净后,剪碎,加生理盐水用玻璃均浆器研磨成单细胞悬液,过200目不锈钢筛网,调整细胞数4×106/ml,台盼蓝拒染试验示活细胞大于95%,取0.05ml瘤细胞悬液接种于每只615小鼠左侧后肢爪垫内侧皮下(移植时避免细胞悬液外溢)。爪垫皮下移植,是获得淋巴道转移的最佳途径,该模型为肺高转移肿瘤模型[1]。

1.5手术切除原发瘤

参考文献[2],并进行预实验,发现爪垫皮下肿瘤10d时生长明显,侵袭程度达Ⅲ～Ⅳ[1]。切除局部原发瘤,造成原发瘤切除后,体内仍有残存瘤细胞存在,与临床肿瘤患者在进展期手术切除后的情况相似。手术方法是先用丝线在小鼠小腿下端原发瘤上端结扎紧,再用手术剪从踝关节处切除整个左侧后肢爪垫(即切除原发瘤),手术时注意避免切口处流血。

1.6实验分组

共进行两批实验,第1批实验在切除原发瘤后,采用随机数字表将60只小鼠随机分为3组,每组20只。(1)模型组:从术后当日开始,每天给生理盐水0.3ml,连续灌胃15d。(2)化疗组:从术后当日给药,给予氟脲嘧啶(52FU)注射液,按照20mg/kg剂量腹腔注射0.2ml,1次/d,连续7d。同时从术后当日开始,每天给生理盐水0.3ml,连续灌胃15d。(3)健脾益肾方治疗组:从术后当日给药,给予健脾益肾方,药物浓度1g/ml,灌胃1次/d,每次0.3ml(相当于人临床用量的15倍),连续灌胃15d。第2批实验分组和施药方法同第1批实验,每组15只。给药结束后,连续观察至术后60d[3]。

1.7检查指标

第1批实验观察计算荷瘤小鼠术后肺转移抑制率和复发瘤瘤质量抑制率,术后15d,颈椎脱臼处死全部小鼠,取肺,4%甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色,组织学观察肺肿瘤转移情况和转移分级[1],计算肺转移率;从荷瘤小鼠左下肢剥离复发瘤称重,计算抑瘤率。局部复发瘤是指前胃癌细胞在爪垫皮下接种后10d,从踝关节处切除局部原发瘤后,少量残存的瘤细胞又在手术部位不断增殖生长而形成局部复发瘤。转移抑制率=[1-治疗组转移率(%)/模型组转移率(%)]×100%;复发瘤瘤质量抑制率=[1-治疗组复发瘤瘤质量/模型组复发瘤瘤质量]×100%。第2批实验观察荷瘤小鼠术后生存期。记录小鼠存活时间,计算各组平均生存时间和中位生存时间,按下列公式计算生命延长率:生命延长率=(治疗组平均生存天数-模型组平均生存天数)/模型组平均生存天数×100%。

1.8统计学方法

采用SPSS11.5软件进行统计学处理,计量资料用x±s,组间比较采用单因素方差分析,多个率的比较采用χ2检验,等级资料采用多个独立样本秩和检验(Kruskal2WallisTest),生存期进行Kaplan2Meier生存分析。

2结果

2.1术后15d前胃癌615小鼠术后肺转移抑制作用

在原发瘤切除后,连续给药15d,在术后15d时全部处死小鼠,检查肺转移情况。模型组、化疗组和健脾益肾方治疗组肺转移率分别为94.4%、73.7%和68.4%;化疗组转移抑制率为21.9%,健脾益肾方治疗组为27.5%。健脾益肾方治疗组和化疗组转移率与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05),但治疗后转移率低于模型组。从转移程度来看,健脾益肾方治疗组和化疗组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。说明健脾益肾方对615小鼠前胃癌术后肺转移有一定的抑制作用,而且可以推迟肺转移。病理切片HE染色显示:模型组肺内广泛分布10个以上转移灶,而且有大转移灶存在,整个肺叶由瘤组织取代。健脾益肾方治疗组和化疗组转移灶数量比模型组减少,直径减小,散在分布。

2.2术后15d前胃癌615小鼠术后复发瘤抑制作用

模型组、化疗组和健脾益肾方治疗组复发瘤瘤质量分别是(1.01±0.93)、(0.26±0.52)和(0.35±0.35)g,健脾益肾方治疗组和化疗组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)。模型组、化疗组和健脾益肾方治疗组复发率分别是94.44%、68.42%和78.95%,三组相比差异无统计学意义(P>0.05)。健脾益肾方治疗组复发瘤抑制率为65.35%,化疗组为74.26%。实验结果表明健脾益肾方和52FU均可明显降低前胃癌在615小鼠下肢局部复发。

2.3前胃癌615小鼠生存期观察

与模型组相比,健脾益肾方治疗组与化疗组荷瘤小鼠术后生存期及中位生存期明显延长,生命延长率为100%和64.71%,以健脾益肾方治疗组效果更明显。从Kaplan2Meier曲线图,能清晰看出不同的变化趋势。