中华结核和呼吸感染1999年第5期第22卷综述
作者：刘宏旭许顺赵惠儒殷洪年
单位：110001沈阳，中国医科大学附属第一医院胸外科。
在过去的50年里，肺癌的疗效提高极其缓慢。非小细胞肺癌(nsclc)患者的生存曲线几乎没有改变；而小细胞肺癌(sclc)患者由于化疗的进展使生存期明显延长，但是几乎没有彻底治愈的病例，因此迫切需要新的有效治疗手段的出现。
随着现代分子生物学的不断发展，尤其是dna重组技术和基因转移技术的逐步成熟，肺癌的基因治疗成为极有发展前景的治疗方法。研究表明，肺癌的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活和凋亡相关基因的改变导致细胞增殖和死亡异常的结果［1］。其发生是多阶段、多步骤、多基因参与的过程，在不同阶段相继或同时有不同基因的改变。在原癌基因中常见发生改变的基因为k-ras、l-myc、c-erbb-2和bcl-2。抑癌基因中常见改变的基因为p53、rb和p16，凋亡相关基因中常见改变的基因为p53、bcl-2、c-myc和ras。针对肺癌发生的分子生物学特点，可以通过基因转移技术，引入新的外源目的基因到肿瘤细胞或其它体细胞内以纠正或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的，这就是肺癌的基因治疗。其可以分为对宿主细胞的基因修饰和对肺癌细胞的基因修饰。肺癌的基因治疗包括：抑癌基因治疗、反义基因治疗、药物敏感基因治疗、免疫基因治疗、多耐药基因治疗和核酶(ribozyme)基因治疗，通常采用的治疗基因见表1［2］，常用的载体为反转录病毒(rv)和腺病毒(av)。一、抑癌基因治疗细胞内抑癌基因的丢失或突变将导致细胞发生恶变。抑癌基因治疗是一种基因替代疗法，即用野生型的抑癌基因靶细胞导入的目的基因肺癌细胞抑癌基因：p53，rb反义癌基因：反义k-ras，反义l-myc，反义c-erbb-2反义多耐药基因：反义mdr-1反义免疫抑制因子基因：反义tgf-β药物敏感基因：hsv-tk，细菌胞嘧啶脱氨酶基因细胞因子基因：il-2，il-4，il-6，il-7，il-12，ifn，tnf，gm-csf抗原物质基因：mhc-1，cea协同刺激信号基因：b7效应细胞细胞因子基因：il-2，il-6，inf，tnf骨髓干细胞多耐药基因：mdr-1，dhfr表1常用肺癌治疗基因替代失活的抑癌基因，从而达到治疗肿瘤的目的。目前研究较多的是p53基因，对于p53基因发生失活的nsclc细胞，通过rv或av载体导入野生型p53基因后发现：肿瘤缩小，细胞恶性程度降低，甚至发生逆转，治疗后分析活检标本发现，肿瘤细胞有p53基因的转移且凋亡细胞明显增多，本结果提示p53可以通过抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡而杀灭肿瘤细胞［3］。对无法切除的ⅳ期nsclc患者，经纤维支气管镜或ct引导的经皮穿刺针局部注入av介导的野生型p53基因，并联合应用化疗药顺铂，发现肿块明显缩小及细胞凋亡增多［4］；对于传统手术及放疗、化疗效果不理想，且肿瘤阻塞气道明显者，可采用导入野生型p53基因和反义k-ras基因治疗。目前此两方案已被美国重组dna顾问委员会(rac)批准为临床治疗方案［5］。当然，转移野生型p53基因治疗肺癌的前提是，肿瘤细胞内必须有该基因缺陷，对p53功能正常的肺癌细胞，此法一般无效。二、反义基因治疗反义基因治疗就是基因封闭或基因灭活，即用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，阻断细胞内异常信号传导，使肿瘤细胞进入正常分化轨道或者引起细胞凋亡。包括反义癌基因治疗，反义多耐药基因治疗，反义免疫抑制因子基因治疗等。反义基因治疗分为反义dna治疗和反义rna治疗。反义dna治疗是指短链dna可插入细胞内dna双螺旋，形成三螺旋结构，阻碍mrna的转录；或短链dna与突变靶基因的mrna相互补，形成rna-dna复合体，使突变基因的表达受到抑制。反义rna是指用一类反义rna影响mrna的加工成熟或直接与mrna结合而抑制癌基因蛋白产物的生成，反义rna治疗在胞浆内进行，技术易行，应用较广泛。1.反义癌基因治疗：有文献报道，将反义k-ras基因的重组表达质粒导入有k-ras基因异常的人nsclc细胞中，该质粒在细胞内表达反义k-rasrna，结果肺癌细胞内k-rasmrna的表达几乎完全抑制，其产物p21蛋白的合成减少了70%～90%，细胞生长速度减慢了3倍，裸鼠成瘤性(tumorigenicity)下降［6］。反义c-erbb-2基因的表达能抑制有c-erbb-2过度表达的肺腺癌细胞的成瘤性［7］。反义l-mycdna导入，能明显抑制sclc细胞的增生。2.反义多耐药基因治疗：肺癌产生耐药性的主要原因是多耐药基因(mdr-1)表达增强及其编码产物p-糖蛋白(pgp)增多。pgp具有药物泵的作用，把进入细胞内的药物运到细胞外，肿瘤细胞因而耐药。因此，逆转耐药基因是成功治疗肺癌的关键。用构建反义mdr-1重组逆转录病毒载体，转染肺腺癌细胞后发现肿瘤细胞内mdr-1mrna的表达受到抑制，pgp表达明显下降，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性增强［8］。除了mdr-1基因外，多耐药相关蛋白基因(mrp)基因在肿瘤耐药中也起重要作用。反义mrprna和反义mdr-1rna共同转染的肺腺癌细胞耐药性下降了约90%。另外，野生型p53基因除了有肿瘤生长抑制和诱导细胞凋亡作用外，还可以增加药物敏感性，而突变型p53基因与肿瘤耐药性密切相关［9］。因此可以用反义突变型p53基因转染肺癌细胞，进行反义基因治疗，以增强对化疗药物的敏感性。3.反义转化生长因子β(tgt-β)基因治疗：该方法同时也是一种免疫基因治疗，通过转染反义核酸可抑制免疫抑制因子tgf-β的产生，因而增强机体的免疫力。由此可见，反义基因治疗具有高特异性及较短的外源基因可封闭较大信息量的突变基因等特点，成为较为合理的治疗方法，有很好地应用和开发前景。但仍有许多问题需要解决，如细胞转染率低，载体在细胞内存在时间较短，寡聚脱氧核苷酸易被降解和摄取率较低等。三、免疫基因治疗免疫基因治疗即采用一定的方法或载体将目的基因导入肿瘤细胞或效应细胞-肿瘤浸润淋巴细胞(til)，然后将表达目的基因的受体细胞输入患者体内，通过提高人体免疫系统对肿瘤细胞的识别、抑制或杀伤能力从而对肿瘤进行治疗的一种方法。治疗途径可以通过直接转染肿瘤细胞制成瘤苗，也可以通过转染效应细胞来增强效应细胞的抗肿瘤能力。1.转染肺癌细胞的免疫基因治疗：肺癌细胞能逃脱机体免疫系统杀伤的重要机制之一为：肿瘤细胞的免疫原性弱，不足以刺激机体免疫系统产生对肿瘤的排斥反应。因此向肿瘤细胞内导入目的基因以增强肿瘤的免疫原性，可以被机体免疫系统识别，从而进行免疫基因治疗。主要包括：(1)抗原物质基因治疗：已证实向肺癌细胞导入主要组织相容复合物ⅰ类基因(mhc-ⅰ)能增强免疫原性，并被肿瘤特异性细胞毒淋巴细胞(ctl)所杀伤，同时mhc-1的表达能降低成瘤性［10］。(2)细胞因子基因治疗：将细胞因子基因通过基因转染技术，导入到某种运载细胞基因组中，使其表达，再将这些运载细胞回输到人体内，通过其聚集在肿瘤局部，持续分泌一定量的细胞因子来激活机体抗肿瘤免疫反应或直接杀伤肿瘤细胞。其优点为，定向力和杀伤力强。通常将细胞因子基因如白细胞介素基因il-2，il-4，il-6，il-7，il-12，肿瘤坏死因子(tnf)，干扰素γ(ifn-γ)和粒/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)基因等导入肿瘤细胞促进抗原表达以增强免疫原性，促进t细胞、自然杀伤(nk)细胞增生和杀伤活性，并降低肿瘤的成瘤性［11］。(3)协同刺激信号基因(b7)基因治疗：作为协同刺激信号(costimulatorysignal)，b7基因导入能促进t细胞增生，提高t细胞杀伤能力，诱导机体免疫系统对抗原的清除。以上为向肿瘤细胞单独导入目的基因，近来有人向肺癌细胞联合导入b7基因和il-12基因［12］、il-2基因和tnf基因［13］、il-2基因和il-6基因［14］，发现能更有效地激活免疫功能达到更佳的抗肿瘤效果。2.转染效应细胞(til)的免疫基因治疗：研究表明：对til细胞做必要的修饰之后，能在很大程度上增强它的杀伤能力，常用于插入til细胞的基因主要为il-2，il-6，ifn-γ，tnf等细胞因子基因。先将肺癌细胞取出，于存在il-2的条件下培养以筛选til细胞，用重组有上述基因的rv转染til细胞，经此修饰的til细胞回输到患者肿瘤组织中去后便能表达il-2，il-6，tnf-γ，tnf等以提高机体对肿瘤的免疫能力［15］。不久前，美国学者hoffmann与国内哈尔滨医科大学联合进行临床试验［16］，将rv介导il-2基因插入的til细胞注入患者胸腔，治疗恶性胸液，结果证实该方法的安全性并有一定的疗效。免疫基因治疗还包括用痘苗病毒载体(vv)介导部分癌胚抗原(cea)基因转染受体细胞，以增强免疫原性；反义tgf-β基因治疗以抑制免疫抑制因子的产生等治疗手段。四、药物敏感基因治疗导入的药物敏感基因在细胞内表达后，可以将原来无毒或低毒的药物转变为细胞毒性产物，进而杀伤细胞。由于细胞本身基因表达以后才对药物敏感，类似细胞自杀，所以该类基因又称自杀基因，主要有：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(hsv-tk)和细菌胞嘧啶脱氨酶基因(bacterialcytosinedeaminasegene)。目前研究最多的为hsv-tk基因，其作用原理为：将hsv-tk基因通过反转录病毒载体导入肺癌细胞中，tk基因表达产物能使没有细胞毒性的环核苷丙氧鸟苷(gcv)活化，活化后的gcv能抑制dna合成，从而特异性杀伤肺癌细胞［17］。与hsv-tk基因作用类似，细菌胞嘧啶脱氨酶基因表达产物，能将5-氟胞嘧啶转化为具有细胞毒和抗代谢活性的5-氟尿嘧啶(5-fu)，从而特异性杀伤肿瘤细胞［18］。药物敏感基因治疗优点：特异性杀伤肿瘤细胞，而正常细胞不受损害；未转染肿瘤细胞有旁观效应(bystandereffect)，因此不需要所有肿瘤细胞都被转导；能同时增加机体对肿瘤细胞的免疫反应。缺点：必须确保只有肿瘤细胞被转导，而正常细胞未被转导［19］。五、多耐药基因治疗将一些抗细胞毒药物的基因(如mdr-1)转移至造血干细胞，以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可能用高剂量的药物杀伤肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。如向造血干细胞中导入二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，可使骨髓中正常细胞获得对氨甲喋呤(mtx)的抗药性；将mdr-1基因导入细胞粘附分子34(cd34)阳性的造血干细胞，可降低化疗药对造血系统的毒性反应［20］。nsclc对化疗通常不敏感，因此多耐药34基因治疗适用于sclc患者。然而，如果造血干细胞已经有高水平表达的mdr-1，浸润于骨髓的肿瘤细胞可能获此基因，从而对化疗耐药，这是该治疗的一个不足。六、核酶基因治疗这是最近发展起来的基因治疗手段。核酶基因是一类具有rna限制性内切酶活性的rna分子，可以识别rna序列中的某些序列并进行有效切割，能特异性灭活rna，因此是一种很有前景的抗病毒和抗肿瘤分子。在有mdr基因表达的肿瘤细胞导入特异的核酶基因逆转录病毒表达载体可有效切割mdr-1mrna，阻断pgp表达，增强药物敏感性，降低耐药［21］。七、存在问题及展望基因治疗作为一种崭新的治疗手段，为肺癌的攻克带来了希望，但目前还很不成熟，存在一些问题，主要表现为：1.缺乏理想的基因载体：理想的基因载体是能将遗传物质安全、高效地转移，并且定点整合到细胞基因组中，在细胞中长期稳定、特异表达或按一定要求调控表达，而且应用方便。目前的载体距离理想载体还有很大差距，但在构建靶向性基因转移的载体方面已取得了一些进展，如通过构建由特异性启动子信号诱导的增生相关蛋白(spa-1)、猿猴病毒40(sv40)、癌胚抗原(cea)等启动子调控的hsv-tk表达载体，能够提高hsv-tk在肿瘤中的特异性表达及减少对正常细胞的损伤［22］。2.难以寻找新的有效目的基因和加强目的基因的功能：肺癌是多基因疾病，这加大了寻找有效目的基因的难度。最初人们怀疑，在肺癌多基因、多阶段演变过程中，单一突变基因的改变是否会明显影响肿瘤的进程。但是，越来越多证据表明某一关键基因的纠正确实能有效地抑制人肺癌细胞的成瘤性，特别是当该基因的纠正将使凋亡途径的活性上调。因此新的有效基因，其表达应该既能抑制、杀伤肿瘤细胞，又能诱导其凋亡［23］。3.联合治疗的前景：联合治疗包括基因治疗与放疗或化疗间的联合，不同基因治疗策略间的联合等。最新研究成果表明，对nsclc患者进行基因治疗结合放疗或化疗［24］；对肺癌肝转移患者行腺病毒介导的自杀基因(hsv-tk)联合细胞因子(il-2)基因治疗均取得较为满意的疗效［25］，可见联合治疗有着极为广阔的前景。可以肯定，随着对肺癌发生分子机制认识的加深和基因工程技术的发展，肺癌基因治疗不久将会有重大突破，并可能成为下个世纪肺癌治疗的主要手段之一。参考文献1mitsudomit,takahashit.geneticabnormalitiesinlungcancerandtheirprognosticimplication.cancerandchemotherapy,1996,23:990-996.2albeldasm.genetherapyforlungcancerandmesothelioma.chest,1997,111suppl:145s-149s.3rothja,nguyendm,kempbl,etal.retrovirus-mediatedwild-typep53genetransfertotumorsofpatientswithlungcancer.naturemedicine,1996,2:985-991.4nguyendm,spitzfr,yenn,etal.genetherapyforlungcancer:enhancementoftumorsuppressionbyacombinationofsequentialsystemiccisplatinandadenovirus-mediatedp53genetransfer.jthoraccardiovascsurg,1996,112:1372-1377.5rothja.clinicalprotocolofoncogeneandtumorsuppressorgeneexpressioninnon-smallcelllungcancer.humgenether,1993,4:483.6mukhopadhyayt,tainskym,cavenderac,etal.specificinhibitionofk-rasexpressionandtumorigenicityoflungcancercellsbyantisenserna.cancerres,1991,51:1744-1748.7casalinip,menards,malandrinsm,etal.inhibitionoftumorigenicityinlungadenocarcinomacellsbyc-erbb-2antisenseexpression.intjcancer,1997,72:631-636.8kobayashih,dorait,hollandjf,etal.reversalofdrugsensitivityinmultidrug-resistanttumorcellsbyanmdr1(pgy1)ribozyme.cancerres,1994,54:1271-1275.9fujiwarat,grimmea,mukhopadhyayt,etal.inductionofchemosensitivityinhumanlungcancercellsinvivobyadenovirus-mediatedtransferofthewild-typep53gene.cancerres,1994,54:2287-2291.10porgadora,tzehovale,vodaie,etal.combinedvaccinationwithmajorhistocompatibilityclassiandinterleukin2gene-transducedmelanomacellssynergizesthecureofpostsurgicalestablishedlungmetastases.cancerres,1995,55:4941-4949.11huntjd,pippinba,landreneaurj,etal.transferandexpressionofthehumaninterleukin-4geneincarcinomaandstromacelllinesderivedfromlungcancerpatients.jimmunother,1993,14:314-318.12katok,okumurak,yagitah,etal.immunoregulationbyb7andil-12genetransfer.leukemia,1997,11suppl:572-576.13ohirat,ohey,heikey,etal.genetherapyforlewislungcarcinomawithtumornecrosisfactorandinterleukin2cdnasco-transfectedsubline.genether,1994,1:269-275.14曹雪涛，章卫平，陶群，等.联合应用白介素2和白介素6基因转染瘤苗抗肿瘤的实验研究.中华医学杂志，1995，75：602-605.15rosenbergsa.immunotherapyandgenetherapyofcancer.cancerres,1991,51suppl:5074s-5079s.16tany,xum,wangw,etal.il-2genetherapyofadvancedlungcancerpatients.anticancerres,1996,161:1993-1998.17hwanghc,smythewr,elshamiaa,etal.genetherapyusingadenoviruscarryingtheherpessimplex-thymidinekinasegenetotreatinvivomodelsofhumanmalignantmesotheliomaandlungcancer.amjrespircellmolbiol,1995,13:7-16.18hogansondk,batrark,olsenjc,etal.comparisonoftheeffectsofthreedifferenttoxingenesandtheirlevelsofexpressiononcellgrowthandbystandereffectinlungadenocarcinoma.cancerres,1996,56:1315-1323.19smythewr,hwanghc,aminkm,etal.useofrecombinantadenovirustotransfertheherpessimplexvirusthymidinekinasegenetothoracicneoplasms:aneffectiveinvivodrugsensitizationsystem.cancerres,1994,54:2055-2059.20sethp,brinkmannu,schwartzgn,etal.adenovirus-mediatedgenetransfertohumanbreasttumorcells:anapproachforcancergenetherapyandbonemarrowpurging.cancerres,1996,56:1346-1351.21高振强，高志萍，刘喜富，等.肿瘤特异表达的mdr-1ribozyme选择性逆转耐药人肺腺癌的耐药性.中国科学.c辑，1997，27：63-66.22russellsj.replicatingvectorsforgenetherapyofcancer:risk,limitationsandprospects.eurjcancer,1994,30a:1165-1171.23sethit.science,medicineandthefutureoflungcancer.bmj,1997,314:652-655.24greenbergerjs,bahris,jetts,etal.considerationsinoptimizingradiationtherapyfornon-smallcelllungcancer.chest,1998,1131suppl:46s-52s.25kwongyl,chensh,kosaik,etal.combinationtherapywithsuicideandcytokinegenesforhepaticmetastasesoflungcancer.chest,1997,112:1332-1337.(收稿：1998-04-30修回：1998-07-14)（责任编辑：jbwq）
