柯萨奇病毒B1接种豚鼠建立多发性肌炎模型

时间 : 2015-12-30 15:10:20 来源：放心医苑网

[摘要]

奇病毒b1接种豚鼠建立多发性肌炎模型中华神经科杂志1999年第3期第32卷论著作者：吴文涛　侯熙德单位：吴文涛　　210002南京军区南京总医院神经内科；侯熙德　　南京医科大学第一附属医院神经内科　　关键词：多发性肌炎；柯萨奇病毒b组；豚鼠

柯萨奇病毒b1接种豚鼠建立多发性肌炎模型

中华神经科杂志1999年第3期第32卷论著

作者：吴文涛侯熙德

单位：吴文涛210002南京军区南京总医院神经内科；侯熙德南京医科大学第一附属医院神经内科

关键词：多发性肌炎；柯萨奇病毒b组；豚鼠

【摘要】目的探讨柯萨奇病毒b1（cvb1）感染与多发性肌炎(pm)发病的关系，利用cvb1接种豚鼠建立pm模型。方法分别用0.1ml（a组）和0.3ml（b组）毒力（tcid50，即50%细胞感染剂量）为10-5的cvb1分别一次性接种24只和36只豚鼠，并用3mg（阈下剂量）兔肌匀浆加完全弗氏佐剂每周免疫1次；另有10只豚鼠，仅用3mg兔肌匀浆加完全弗氏佐剂每周免疫1次为对照组（c组），共5周。结果a、b组3周后均有豚鼠出现四肢肌无力等症状，肌酶谱明显升高，豚鼠股肌病理呈局灶性炎性改变，c组无异常。a、b组5周后的肌酶谱升高阳性率存在显著差异（a组为11.8%，b组为38.2%)。结论cvb1感染是pm发病诱因之一，其毒力及接种量与pm的发病相关。

studyoncoxsackievirusb1-inducedpolymyositisinguineapigmodels

wuwentao*，houxide.*departmentofneurology,generalhospitalofnanjingcommand,pla,nanjing210002

【abstract】objectivetostudytherelationbetweeninfectionwithcoxackievirusb1(cvb1)andonsetofpolymysitisinthepolymyositismodelsofguineapigsinfectedwithcvb1.methodsixtyguineapigswereinnoculatedwith0.1mlofcvb1ingroupaandwith0.3mlofcvb1ingroupb.thecvb1toxicitybeing10-5tcid50.thentheywereimmunizedonceaweekwith3mgrabbitmusclehomogenatesinfreund′scompleteadjuvant,tenguineapigsimmunizedonceaweekonlywith3mgrabbitmusclehomogenatesinfreund′scompleteadjuvantasacontrol(groupc).resultssomeguineapigsinnoculatedwithcvb1showedmuscularweaknessoftheirlimbs,theserumenzymeswereevidentlyelevatedandthehistopathological,muscularchangesofpolymyositiswereconfirmed3weeksaftertheviralinfection,theguineapigsofgroupcwerenormal.thepositiveratesofelevationinmuscleenzymesweresignificantlydifferentbetweenthetwogroupsofguineapigs.ingroupaelevationinmuscleenzymeswasfoundin11.8%,whereasingroupbitappearedin38.2%fiveweeksaftertheviralinfection.conclusionnotonlyinfectionwithcoxsackievirusb1couldinducepmbutalsoitsquantityandtoxicitywerecorrelatedwiththeonsetofpolymyositis.

【keywords】polymyositiscoxsackievirusesbguineapigs

柯萨奇病毒b1（cvb1）接种诱发多发性肌炎(pm)的小鼠模型，在国外已建立，国内尚未见报道。我们在柯萨奇病毒(cvb)诱发实验性pm的初步研究中，比较了毒力（tcid50，即50%细胞感染剂量）为10-5的cvb的血清型和感染量与致病性的关系，发现一定量的一定毒力的cvb1能诱发建立pm豚鼠模型。我们在本研究中增加了接种的豚鼠数量，重复cvb1感染试验，以进一步确定cvb1感染与pm的相关性。

材料和方法

1.动物:70只短毛英国种豚鼠(南京医科大学动物中心提供)，体重300～500g。雌雄各半,随机分组。

2.肌匀浆的制备:取家兔股部肌肉，剔除神经、血管、筋膜等组织，加适量生理盐水，用刀式匀浆机10000r/min连续3次，30秒/次，粗纱布过滤后，经超声匀浆机匀浆肌细胞，每次10分钟，连续3次制成匀浆，涂片经mgg染色镜检，未见完整细胞及细胞核结构，置-20℃备用。此匀浆经考马斯亮蓝法测定蛋白含量为20mg/ml。

3.病毒悬液:cvb1毒种来源于中国预防医学科学院病毒研究所，在南京医科大学微生物教研室用vero细胞传代，滴定tcid50为10-5，置-20℃备用。

4.病毒接种及肌匀浆免疫：cvb1悬液于第1周一次性腹腔注射，肌匀浆每周于颈部或背部皮下注射1次。动物分3组。a组:豚鼠24只，每只cvb1悬液0.10ml，每只每次0.15ml肌匀浆+0.15ml弗氏佐剂（cfa）。b组:豚鼠36只，每只cvb1悬液0.30ml，每只每次0.15ml肌匀浆+0.15mlcfa。c组：豚鼠10只，每只每次0.15ml肌匀浆＋0.15mlcfa。

5.肌酶谱检测:心脏穿刺取血，每次取血2ml，于干净试管离心5分钟(3000r/min)，取血清0.5ml，用olympus-au800生化自动分析仪检测。

6.病理检查:病毒接种后第3、5周，断颈或心脏注射空气栓子处死豚鼠，或取血死亡时立即取材，取双侧股肌及心、肝、肾、脑及周围神经组织，用体积分数为0.10的甲醛固定，石蜡包埋连续切片，he染色镜检。

7.超微结构检查:取肌酶谱升高的豚鼠双侧股肌，用体积分数为0.05的戊二醛固定，超薄切片,常规电镜染色后观察。

结果

一、病毒接种后动物表现

接种后第3周a、b两组部分豚鼠出现倦怠、食欲下降、活动减少、双下肢肌无力;至第5周生长缓慢、体重下降、四肢对称无力、行走缓慢摇摆。c组豚鼠未见异常症状。

二、肌酶谱

分别于病毒接种前及接种3、5周后检测a、b两组肌酶谱。结果表明，病毒接种3、5周后肌酶谱较接种前明显升高（表1），接种3周后与接种前的cpk、ldh和ast值经t检验，差异均有极显著意义(t=7.14、5.85、6.91，p＜0.001)，其中，肌酶谱以cpk升高幅度最大，最高达7660iu/l。但病毒接种5周后肌酶谱较3周后升高不明显，二者差异无显著意义。c组单用3mg兔肌匀浆免疫前与免疫3、5周后的肌酶谱比较，差异无显著意义。以+1.96s为正常肌酶谱的最高限，则cpk、ldh、ast的正常值最高限分别为857iu/l、385iu/l、101iu/l。a、b两组豚鼠肌酶谱升高阳性率见表2。由表2可知，a、b两组豚鼠病毒接种5周后与3周后的肌酶谱升高阳性率基本无差异，但b组肌酶谱升高阳性率高于a组，以两组5周后肌酶谱升高阳性率做χ2检验，差异有显著意义（χ2=3.85,p＜0.05)。

表1病毒接种前后豚鼠肌酶谱(iu/l)

肌酶接种前3周后5周后cpk392±2382734±1308*3263±1697ldh200±94383±124*313±117ast66±18207±81*112±45*与病毒接种前相比，p＜0.001

表2a、b两组豚鼠肌酶谱升高率的比较

分组3周后△5周后a组14.3%(1/7)11.8%(2/17)b组33.3%(3/9)38.2%(13/34)**与a组相比，p＜0.05；△病毒接种3周后，为减少因心脏穿刺取血致豚鼠死亡，a组只随机检测了7只豚鼠有效血清，b组只检测了9只

三、病理检查

肌酶谱升高的豚鼠股肌纤维呈多灶性炎性改变，以单核细胞和多形核细胞为主，直接侵犯肌纤维，病灶中可见肌纤维溶解及坏死(图1～4)，未见肌纤维再生。病毒接种5周后与3周后的肌纤维病理改变无明显差别。心、肝、肾、脑及周围神经组织未发现异常，病毒接种前及c组的豚鼠肌病理检查也未见异常。

图1肌纤维呈多灶性炎性改变，周围部分纤维变性he×100

图2肌纤维及血管周围炎性病变，炎细胞以单核细胞和中性粒细胞为主he×400

图3肌纤维灶性炎性病变及血管周围炎性病变he×100

图4肌纤维炎性病变he×400

四、超微结构检查

光镜下呈病理阳性改变的股肌标本在电镜下观察，可见肌纤维间淋巴细胞直接浸润。肌纤维横纹、细胞核及线粒体未见异常。

讨论

pm病因和发病机制迄今不明，有研究认为与自身免疫异常有关［1］。诱因可能与感染、肿瘤及其他自身免疫性疾病有关，其中病毒感染渐引起人们的重视。

用cvb1接种豚鼠建立pm模型在国内外尚未见报道。为此，我们在cvb诱发豚鼠多发性肌炎的初步研究中，初步确定了cvb病毒血清型的致病性、毒力和其接种量及肌匀浆的阈下剂量（单独用该剂量免疫不致病）［2］。我们增加了豚鼠数量，用相同毒力的cvb1接种重复试验。结果表明，cvb1接种建立pm豚鼠模型方法具有较好的可重复性。

我们建立的pm豚鼠模型，从症状、肌酶谱及病理改变均符合bohn提出的pm诊断标准［3］。实验结论如下:（1）cvb1接种是pm发病诱因之一。（2）病毒接种量、毒力与多发性肌炎发病相关。（3）病毒接种诱发的pm呈急性或亚急性起病。在实验中，多次用小剂量（3mg）兔肌匀浆免疫豚鼠，目的在于增强病毒接种诱发的对骨骼肌的特异自身免疫损害，提高发病率和避免并发其他疾病，而单用该剂量兔肌匀浆免疫不致病，原因是抗原量不足，如预实验［2］和本实验c组的结果。用少于5mg的兔肌匀浆注射豚鼠诱发肌炎，国内外未见报道。

单用cvb1接种诱发成功建立pm新生鼠模型，在国外已有报道［4，5］。我们在预实验中单用cvb1接种豚鼠，发病率极低，原因是豚鼠对肠道病毒不敏感，故本实验未设单纯cvb1组。单用cfa注射豚鼠不致病，已有研究报道［6］，本实验c组结果也能证明此点。

肌酶谱的升高多在病程的活动期，cpk、ldh、ast广泛存在于肌细胞中，当肌纤维炎性病变时，肌细胞被破坏或肌细胞膜通透性增高，上述肌酶谱就被释放至血清中。本实验中，豚鼠肌酶谱在病毒接种后第3周已见升高，其中cpk最高已达7660iu/l，但至第5周肌酶继续升高不明显，阳性率也未见上升，结合豚鼠症状，提示：（1）病毒接种诱发的肌炎主要呈急性或亚急性起病，与其他原因诱发的肌炎呈亚急性或慢性起病的特点不同［6］。（2）病毒接种诱发的肌炎可能存在自限性，有待进一步研究。不同量的病毒接种豚鼠组的肌酶谱升高阳性率均不高（本实验最高为38.2%），且存在明显差异，结合有关研究结果，提示不仅病毒的毒株、毒力和接种量与pm发病有关，且与动物的种类、年龄和体重等相关［7］。豚鼠的肌酶谱升高幅度基本与症状和病理改变程度相符，其中以cpk升高幅度最大，特异性最高。

发病豚鼠的股肌病理检查结果以肌纤维中的炎细胞浸润灶为主，伴有局灶的肌纤维变性坏死，未见肌纤维再生。比较病毒接种后第3、5周的病理改变，加重不明显。炎细胞以单核、多形核细胞为主，与其他研究一致［4］。推测可能是病变早期的非特异性免疫反应，单核、多形核细胞对病毒感染的肌纤维进行吞噬。是否诱发体液和细胞免疫取决于机体的免疫机能、病毒接种量和毒力等，病毒接种后肌炎可能存在的自限性是否也在于此，尚需深入研究。

本课题为江苏省教委自然科学基金资助(no.教95046)

参考文献

1targoffin.immunemanifestationsofinflammatorymuscledisease.rheumaticdiseaseclinicsofnorthamerica,1994，20:857-875.

2吴文涛，储旭华，侯熙德.柯萨奇病毒诱发实验性多发性肌炎的初步研究.卒中与神经疾病,1996,3:176-178.

3bohana，peterjb.polymyositisanddermatomyositis.nengljmed,1975,292:403-407.

4raycg，minnichll，johnsonpc.selectivepolymyositisinducedbycoxsackievirusb1inmice.jinfectdis,1979,140:239-243.

5ytterbergsr，mahowaldml，messnerrp.coxackievirusb1-inducedpolymyositis.jclininvest,1987,80:499-506.

6侯熙德，蔡昭，沈鸣九,等.多发性肌炎动物模型的研究.中国实验免疫学杂志,1993,5:3-7.

7haysap，gamboaet.acuteviralmyositis.in:engelag,bankerbq,eds.myology.newyork:mackrow-hill,1986.1456-1457.

(收稿：1998-08-11修回：1998-11-06)

（责任编辑：jbwq）