实验性变态反应性脑脊髓炎几种细胞因子的检测

实验性变态反应性脑脊髓炎几种细胞因子的检测

中国神经免疫学和神经病学杂志2000年第1期第7卷论著

作者：张凤蕴吕雪莹于伟玲王丽群王琳李殿俊

单位：哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨150086

关键词:实验性变态反应性脑脊髓炎；细胞因子

摘要：目的和方法为研究细胞因子在实验性变态反应性脑脊髓炎(eae)及多发性硬化(ms)发病机制中的作用，用ctll细胞株滴定法检测了eae动物脾细胞培养上清中白细胞介素-2(il-2)的生物学活性，用elisa分别检测了白细胞介素-4(il-4)及干扰素-γ(ifn-γ)水平。结果eae组il-2活性及ifn-γ水平均显著高于正常对照组(均为p＜0.05)，而其il-4水平显著低于对照组(p＜0.01)。结论il-2、ifn-γ等细胞因子参与了eae的发病，并对il-4的产生有抑制作用。

中图分类号：r392文献标识码：a

文章编号：1006-2963(2000)01-045-04

assayofsomekindsofcytokinesinexperimental

allergicencephalomyelitismodel

zhangfeng-yun，l%26uuml;xue-ying，yuwei-ling,

wangli-qun，wanglin,lidian-jun

(departmentofimmunology,harbinmedicaluniversity,harbin150086,china)

abstract：objectiveandmethodstoinvestigatecytokineeffectsoneaepathogenesis,il-2bioactivityinthesupernatantofculturedspleencellsofeaemodelwasassayedwithctllcelllinetitration;il-4andifn-γlevelsweredetectedwithelisa.resultsil-2bioactivityandifn-γlevelsineaegroupweresignificantlyhigherthanthatofcontrolgroup(p＜0.01;p＜0.05).il-4levelwassignificantlylowerthanthatofcontrolgroup(p＜0.01).conclusionsomekindsofcytokines(il-2andifn-γ)wereshowedtheircontributiontothepathogenesisofeae,andinhibitingil-4production.

keywords：experimentalallergicencephalomyelitis;cytokine

实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentalallergicencephalomyelitis,eae)是研究多发性硬化等人类神经系统脱髓鞘疾病的动物模型。多发性硬化(ms)发病机制尚不完全清楚，但已证明是在自身抗原刺激下产生的局限于中枢神经系统的迟发型超敏反应性自身免疫病。

近年来，细胞因子在自身免疫应答的作用日益引起人们的关注。为研究细胞因子在多发性硬化及eae免疫学发病机制中的作用，我们建立了eae动物模型，并检测了脾细胞培养上清中il-2、il-4及ifn-γ3种细胞因子。

1材料和方法

1.1eae动物模型的建立

1.1.1动物：豚鼠28只(购自中国农业科学院哈尔滨市兽医研究所)，2月龄，雌性，体重300g左右，分为2组，实验组21只，正常对照组7只。

1.1.2髓鞘碱性蛋白(mbp)：按kie方法稍加改进［1］，自提牛脑mbp，经sds-page及氨基酸组分分析鉴定，证实为mbp，蛋白质量浓度为3.2g/l。

1.1.3eae的诱发：mbp加福(氏)完全佐剂。乳化后注入豚鼠后足掌皮下，按体重0.66μg/g注入；正常对照组注入等量生理盐水加佐剂。

1.2脾细胞悬液的制备于免疫后第8、15、21天(d)分别处死eae组7只豚鼠，对照组动物于第8d处死。无菌取脾，制备脾细胞悬液，以含10%(体积分数)小牛血清的rpmi-1640加入24孔反应板中，置37℃、5%(体积分数)co2培养箱培养，于第24、48、72h吸取上清，分别用于il-2、il-4、ifn-γ检测。

1.3实验方法

1.3.1il-2的生物活性检测：以il-2依赖细胞株ctll-2滴定。将待测样品加入96孔反应板中，倍比稀释，每一样品做8个稀释度，每孔50μl；取对数生长期的ctll-2细胞，洗3次后再以含20%(体积分数)小牛血清的rpmi-1640调整其细胞含量为6×105/ml，加至上述各孔，50μl/孔，置37℃、5%(体积分数)co2培养箱中共育20h，每孔加入5g/lmtt10μl，5h后弃上清，加20g/lsds-500g/ldmf裂解细胞，测a570值，由标准曲线上求il-2活性单位，以u/ml表示。

1.3.2il-4水平检测：用双抗体夹心elisa检测(试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司)。

1.3.3ifn-γ水平检测：用双抗体夹心elisa检测(试剂盒购自第二军医大学微生物教研室)。

1.4统计学处理实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用组间双侧t检验方法。

2结果

2.1eae模型诱导结果eae组动物约在免疫后8～9d出现症状，21只豚鼠均发病，表现不同程度体重减轻，肢体无力，继之瘫痪，有的抽搐死亡。取脑组织及脊髓做病理检测，在光镜及电镜下可见血管周围炎细胞浸润及脱髓鞘等改变，证实eae模型成功。

2.2il-2生物活性由附表可见，eae组脾细胞培养上清中il-2的生物学活性明显高于正常对照组(p＜0.01)。

2.3il-4水平附表表明eae组il-4水平明显低于正常照组(p＜0.01)。

2.4ifn-γ水平由附表可见，eae组ifn-γ水平明显高于对照组(p＜0.05)。

附表eae模型脾细胞上清il-2、il-4及ifn-γ水平

tableil-2,il-4andifn-γlevelsinthesupernatantofculturedspleencellsofeaemodel(±s)

groupnil-2(u/ml)ρ(il-4)/pg·ml-1

ρ(ifn-γ)/ng·ml-1

normal751.27±8.5419.85±5.600.38±0.13

eae21178.14±48.72*9.09±2.67**0.89±0.28***

*p＜0.01comparedwithnormalgroup;**p＜0.01comparedwithnormalgroup;***p＜0.05comparedwithnormalgroup

3讨论

多发性硬化(ms)是神经系统的自身免疫病，主要特点是病变局部髓鞘破坏，但其确切发病机制尚不清楚。以mbp等髓鞘成分免疫动物造成ms的实验动物模型eae对研究ms的发病机制及治疗有重要意义。

有报道指出，cd4＋t细胞是对mbp产生免疫应答的主要细胞，处于激活状态的cd4＋细胞产生细胞因子参与免疫应答。cd4＋t细胞分为th1细胞和th2细胞，它们产生的细胞因子种类不同。th1型细胞因子主要是il-2、ifn-γ及tnf-β等；th2型细胞因子主要包括il-4、il-10及tgf-β等。这种th1/th2模式(th1/th2paradigm)帮助了解某些疾病的发病机制。romagnani［2］指出，th1型细胞因子参与某些器官特异性自身免疫病的发病，如实验性自身免疫性葡萄膜炎、胰岛素依赖性糖尿病及自身免疫性甲状腺疾病等。

本检测结果表明，eae动物脾细胞培养上清中il-2生物活性及ifn-γ水平明显高于正常对照组，说明il-2及ifn-γ参与eae及ms发病。

th1型细胞因子il-2可以促进细胞毒性t细胞(ctl)及自然杀伤细胞(nk)等活化、增殖；ifn-γ能激活巨噬细胞和单核细胞，造成血管周围炎细胞浸润，产生中枢神经系统的迟发型超敏反应性疾病。olsson［3］提出，在ms及eae中，由于th1细胞过度活化，细胞因子表达出现紊乱，il-2及ifn-γ水平增高，而且其增高程度与疾病的严重程度相平行。

关于il-4在ms及eae发病机制中的作用研究较少。khoury［4］报道，在eae发病高峰期病变处有il-1、il-2、il-6、il-8、ifn-α、ifn-γ等炎性细胞因子存在，但无il-4、tgf-β等抑制性细胞因子。我们检测的eae组脾细胞培养上清中il-4水平明显低于正常对照组。

il-4作为th2型细胞因子，能下调th1型细胞活性，抑制th1型细胞因子如ifn-γ的作用，给nod小鼠投以il-4可防止或延缓小鼠产生th1细胞介导的自身免疫病ⅰ型糖尿病［5］。产生口服耐受和eae恢复期的动物il-4表达增强［6］。因此，il-4可作为免疫调节因子抑制迟发型超敏反应，治疗eae［7］。

本实验结果证明，th1型细胞因子il-2、ifn-γ参与eae发病，是造成eae慢性炎症反应的主要细胞因子。th1型细胞因子可以抑制th2型细胞因子的产生，反之亦然。因此认为在疾病急性期由于il-4水平降低，不能抑制th1型细胞因子，所以动物发生eae。

研究细胞因子与eae发病机制的关系对研究ms的发病机制及治疗ms有重要意义。

基金项目：黑龙江省自然科学基金资助项目（0-9622）

作者简介：张凤蕴（1943年生），女，山东省龙口市人，教授，主要从事神经免疫及移植免疫研究。

参考文献：

［1］周建年，杨贵贞.髓磷脂碱蛋白的提取、鉴定及初步应用的研究［j］.白求恩医科大学学报.1985,11：17-20.

［2］romagnanis,theth1/th2paradigm［j］.immunologytoday,1997,18(6)：263-266.

［3］olssont.roleofcytokinesinmultiplesclerosisandexperimentalautoimmuneencephalomyelitis［j］.eurjneurol,1994,1：7-21.

［4］khourysj,hancockmw,weinerhl.oraltolerancetomyelinbasicproteinandnaturalrecoveryfromexperimentalautoimmuneencephalomyelitisareassociatedwithdownregulationofinflammatorycytokinesanddifferentialupregulationoftransforminggrowthfactor-β,interleukin-4,andprostaglandineexpressioninthebrain［j］.jexpmed,1992,176：1355-1364.

［5］rapoportmj,jaramilloa,ziprisd,etal.interleukin-4reversestcellproliferativeunresponsivenessandpreventstheonsetofdiabetsinnonobesediabeticmice［j］.jexpmed,1993,178：87-99.