【关键词】pbc；,gnly；逆转录-聚合酶链反应
【摘要】目的用实时荧光定量rt-pcr的方法测定pbc患者外周血中gnly的基因表达水平，探讨gnly在原发性胆汁性肝硬化（pbc）的表达及意义。方法采用taqman探针技术，以18srna为内对照，测定了60例pbc性心脏病患者外周血中gnlymrna的含量，以健康对照组为对照。结果gnlymrna在60例pbc患者的表达范围为5.35×107～4.61×109拷贝/μgrna，均值为（2.7±2.5）×108拷贝/μgrna；100例健康对照者均值为（3.0±1.9）×107拷贝/μgrna。pbc组gnlymrna的含量显著高于疾病对照乙型肝炎肝硬化组和健康对照组（p<0.01）。结论通过fq-pcr方法检测出pbc患者gnlymrna的含量显著高于健康对照组，gnly表达与pbc的发生发展存在一定的关联性。
【关键词】pbc；gnly；逆转录-聚合酶链反应
原发性胆汁性肝硬化（primarybiliarycirrhosis，pbc）是一种原因不明的自身免疫性
肝病，胆小管出现进行性破坏性炎症反应，肝内出现慢性胆汁淤积，进一步发展成
肝纤维化和肝硬化，最终患者只能依靠肝移植免于死亡［1］。pbc患者胆管破坏伴随着门脉淋巴细胞浸润，主要为活化的cd8+t和cd4+t细胞，cd8+t细胞介导的免疫反应参与pbc中胆管上皮细胞和肝细胞破坏的发病过程［2］。颗粒溶素（granulysin，gnly）是nk（naturalkiller，nk）细胞和细胞毒性t淋巴细胞（ctl）表达的一种溶细胞分子，在机体免疫应答过程中，它先通过胞吐作用从胞浆颗粒中排出，然后在胞外发挥其细胞毒作用［3］。本研究主要是利用实时荧光定量rt-pcr的技术，建立一种灵敏快速地检测gnly基因表达的方法，并从分子水平探讨gnlymrna在pbc患者外周血中的表达及临床意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象60例经临床确诊的pbc患者均为长征医院住院病人，其诊断均符合美国肝病学会（aasld）2000年推荐的pbc诊断标准［4］，其中男5例，女55例，男女比例为1：11，发病年龄（45.6±10.2）岁。正常对照组为100例健康体检者。
1.1.2主要仪器和试剂rneasyminikit（qiagen），taqmanreversetranscriptionregents（appliedbiosystem），淋巴细胞分离液（上海生化试剂公司），taqman2×pcrmastermix，taqmanreversetranscriptionregents（appliedbiosystem），引物及taqman水解探针的合成（上海生工）、dna测序分析（上海联合基因生物技术公司）。geneamp7900sequencedetectionsystems（美国pebiosystems公司）。
1.1.3引物、探针的设计与合成用beacondesigner2.1软件设计gnly和18srrna的基因专一性的引物和探针，gnly上游引物：5’actgaagaagatggtggataagcc3’；下游引物：5’gccctgggtaactctagactga3’；探针:famcggaacctccagtcagaagaccagatamra。内参18srrna上游引物：5’acatccaaggaaggcagcag3’；下游引物：5’ttcgtcactacctccccgg3’；探针:famcgcgcaaattacccactcccgatamra。正反向引物、taqman探针（famtamra标记）均由上海生工生物技术公司合成。
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