调中颗粒对大鼠混合反流性食管炎的治疗作用及其机制

作者：时昭红,苏文,张介眉,郝建军,冯云霞,陈洲

【摘要】目的：观察调中颗粒对混合反流性食管炎大鼠食管黏膜病理改变及血清氧自由基的影响，探讨调中颗粒治疗反流性食管炎的作用机制。方法：58只SD大鼠随机分成5组：调中颗粒组、半夏泻心汤组、西沙必利组、模型组和假手术组。通过食管十二指肠端侧吻合术法复制混合反流性食管炎大鼠模型，造模结束后灌胃给药，连续给药12d后处死大鼠，HE染色法观察病理变化，免疫组织化学SABC法检测大鼠食管黏膜中肿瘤抑制蛋白质p53和增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）的表达，比色法检测血清中丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase,GSHPx）的活性。结果：治疗结束后，与模型组比较，调中颗粒组、半夏泻心汤组和西沙必利组大鼠食管黏膜组织病理改变有不同程度的修复。与模型组比较各治疗组血清MDA含量下降（P<0.05,P<0.01），SOD和GSHPx活性升高（P<0.05,P<0.01），p53和PCNA表达减少（P<0.01）。调中颗粒在降低MDA含量、提高SOD和GSHPx活性方面优于西沙必利片（P<0.05），减少PCNA和p53表达方面优于半夏泻心汤和西沙必利片（P<0.05）。结论：调中颗粒可以降低MDA的含量，提高SOD和GSHPx的活性，减少PCNA和p53的表达，促进黏膜的修复，可能为其治疗反流性食管炎的作用机制。

【关键词】食管炎,反流性;复方;氧自由基;增殖细胞核抗原;肿瘤抑制蛋白质p53;大鼠

　　Objective:ToexplorethemechanismofTiaozhongGranule（TZG）,acompoundtraditionalChineseherbalmedicine,intreatingratswithmixedrefluxesophagitis.Methods:FiftyeightSDratswererandomlydividedintountreatedgroup（n=12）,shamoperatedgroup（n=10）,TZGtreatedgroup（n=12）,BanxiaXiexinDecoction（BXXXD）treatedgroup（n=12）andcisapridetreatedgroup（n=12）.Mixedrefluxesophagitiswasinducedbyesophagoduodenumendtosideanastomosis.Fourweekslater,theratswereorallyadministeredtwicedailyfor12days.PathologicalchangesofesophagusmucousmembranewereobservedbyusingHEstaining.Theexpressionsofproliferatingcellnuclearantigen（PCNA）andp53intheesophagustissueweredetectedbyimmunohistochemicalSABCmethod.Spectrophotometricmethodwasusedtodetectthecontentofmalondialdehyde（MDA）andtheactivitiesofsuperoxidedismutase（SOD）andglutathioneperoxidase（GSHPx）inserum.Results:Comparedwiththeuntreatedgroup,pathologicalchangesofesophagusmucousmembranewererelievedindifferentdegreesinTZGtreatedgroup,BXXXDtreatedgroupandcisapridetreatedgroup.ContentofMDAandexpressionsofPCNAandp53wereobviouslydecreasedinthethreetreatedgroups（P<0.01）,andtheactivitiesofSODandGSHPxweresignificantlyincreasedinthethreetreatedgroups（P<0.05,P<0.01）.TZGhadbettereffectsthancisaprideindecreasingthecontentofMDAandincreasingtheactivitiesofSODandGSHPx（P<0.05）.TZGwasbetterinaspectofreducingtheexpressionsofPCNAandp53thanBXXXDandcisapridetablets（P<0.05）.Conclusion:TiaozhongGranulecantreatmixedrefluxesophagitisinrats,anditsactionmechanismsmaybeassociatedwithdecreasingtheexpressionsofPCNAandp53inesophagusmucousmembrane,reducingthecontentofMDAandincreasingtheactivitiesofSODandGSHPxinserum.

　　Keywords:esophagitis,reflux;compoundrecipe（TCD）;oxygenradicals;proliferatingcellnuclearantigen;tumorsuppressorproteinp53;rats

反流性食管炎（refluxesophagitis,RE）是一种以胃肠内容物反流入食管造成黏膜损伤为特征的常见消化道疾病。近年来其并发的Barrett食管（Barrett'sesophagus,BE）和食管腺癌（esophagealadenocarcinoma，EAC）的发病率有增高趋势［1］，但目前该病的西药疗效尚不能令人满意。调中颗粒（TiaozhongGranule,TZG）原名胃必欢，是临床运用20余年，已通过湖北省食品药品监督管理局院内制剂审批（批准文号：鄂药制字2005第z01112号）的治疗RE的经验方剂，为进一步探讨其疗效及作用机制，我们在成功建立混合RE大鼠模型的基础上，观察调中颗粒对食管黏膜的影响。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1动物

　　清洁级健康SD大鼠，雌雄各半，体质量（180±20）g。由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（合格证号：19058；编号：TJLA2005308）。

　　1.1.2药物

　　调中颗粒（姜半夏10g、黄连6g、黄芩8g、炮姜3g、太子参15g、甘草6g、大枣10g、杏仁10g、厚朴10g）由武汉市中西医结合医院制剂室提供（批号：050408），6g/袋，用蒸馏水稀释成浓度为2g/ml的溶液（按颗粒剂计算）。半夏泻心汤（半夏12g，黄芩、干姜、党参、炙甘草各9g，黄连3g，大枣4枚）药物及制剂（制备成浓度为1.74g/ml的汤剂，按生药计算）由武汉市中西医结合医院制剂室提供（批号：050607）。西沙必利片，5mg/片，由西安杨森制药有限公司生产（国药准字H1096289，批号：040521939），用蒸馏水稀释成0.02mg/ml的溶液。

　　1.1.3主要仪器与试剂　　BX60型Olympus光学显微镜和OlympusBX50显微摄影系统由日本奥林巴斯公司生产；HUMIAS2000医学图文分析系统由武汉千屏影像技术有限责任公司提供；TU1800S型紫外分光光度计由北京普析通用公司生产；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase,GSHPx）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；鼠抗人肿瘤抑制蛋白质p53单克隆抗体、鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）单克隆抗体、SABC免疫组化染色试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

　　1.2实验方法

　　1.2.1分组及喂养

　　考虑动物模型复制过程中动物有一定的死亡率［1］，酌情调整各组大鼠数量。58只SD大鼠运用随机数字表随机分组，调中颗粒组、半夏泻心汤（BanxiaXiexinDecoction,BXXXD）组、西沙必利组和模型组，每组12只，假手术组10只。分笼饲养于钢丝网底塑料笼内，每笼4只，每组3笼，自由取食。

　　1.2.2混合反流性食管炎模型的建立

　　造模方法参照王雯等［2］的食管十二指肠端侧吻合术法。大鼠适应环境4～7d后，用1%戊巴比妥钠麻醉（30mg/kg，腹腔注射），将大鼠固定于手术台，取上腹部正中切口进腹。进腹后将食管下段分离出神经和血管，结扎贲门，切断食管，缝合贲门并荷包包埋入胃中，保留全胃。于距幽门约1cm处纵行切开十二指肠壁约0.5cm，与食管下端行食管十二指肠端侧吻合术，关腹前腹腔内注入生理盐水1ml及硫酸庆大霉素2万U。术后禁食24h，不禁水。观察大鼠饮食、粪便及活动情况。假手术组行假手术，进腹后将食管下段分离出神经和血管后关腹。造模时间为4周。造模过程中因部分大鼠不能耐受实验而死亡，造模结束时调中颗粒组、半夏泻心汤组、西沙必利组、模型组、假手术组分别剩余10、9、8、9、10只大鼠。

　　1.2.3给药与取材方法

　　造模成功24h后开始灌胃给药，调中颗粒组予调中颗粒10.03g/（kgd）、半夏泻心汤组予半夏泻心汤8.71g/（kgd），西沙必利组给予西沙必利片0.09mg/（kgd），假手术组和模型组给予同体积的生理盐水灌胃，每天2次，共给药12d。给药结束后禁食不禁水12h，心脏取血，置于5ml的抗凝采血管中，3500r/min，离心10min，取上清备用。自胃食管交界部位向上1cm处（向咽喉方向）取一段长约1cm的食管，固定于10％福尔马林中，HE染色后光镜观察病理改变。同时取食管下端大小约为0.5cm×0.5cm食管壁全层一块，立刻置于4℃4%的多聚甲醛中固定2h，用于免疫组化检测。

　　1.2.4观测指标和方法

　　1.2.4.1血清中MDA含量和SOD、GSHPx活性检测

　　采用比色法，具体操作步骤按试剂盒说明进行。

　　1.2.4.2食管黏膜中PCNA和p53表达的检测

　　采用SABC法，具体操作步骤按试剂盒说明进行。染色结果判定标准均以细胞核有明确棕黄或褐色着色而胞质不着色为阳性细胞。通过BX60型Olympus光学显微镜（×400倍）观察食管黏膜中PCNA和p53免疫阳性细胞的分布，每张切片随机选取5个视野，用HUMIAS2000医学图文分析系统分析食管黏膜中PCNA和p53阳性细胞的灰度值。PCNA和p53含量与灰度值呈正比，灰度值越大，表示PCNA和p53含量越多。

　　1.2.4.3病理变化

　　参照1999年8月全国反流性食管病（炎）研讨会制定的“反流性食管病（炎）诊断及治疗方案（试行）”中反流性食管炎分级标准：鳞状上皮增生、黏膜固有层乳头延伸、上皮细胞层内炎细胞浸润为轻度；轻度基础上出现黏膜糜烂为中度；轻度基础上有溃疡形成和（或）Barrett食管改变为重度［3］。

　　1.3统计学方法

　　计量资料实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析，组间比较用q检验；等级资料的假设检验采用Ridit分析。应用SPSS13.0统计软件分析数据。

　　2.1大鼠食管黏膜组织病理改变

　　造膜6周后假手术组大鼠食管黏膜上皮完整，基底侧的结缔组织呈乳头状突向上皮；调中颗粒组大鼠食管黏膜基本正常；西沙必利组大鼠食管黏膜固有层乳头延伸，仍有炎细胞浸润，多数属于轻度改变；半夏泻心汤组大鼠食管黏膜基本修复，细胞排列紊乱；模型组大鼠食管黏膜鳞状上皮增生，黏膜固有层乳头延伸，出现炎细胞浸润，黏膜糜烂，有溃疡形成，多数属于重度改变。见图1。经过Ridit分析，模型组和假手术组大鼠食管黏膜病理分级比较差异有统计学意义（P<0.01）。模型组病理分级和西沙必利组、半夏泻心汤组、调中颗粒组病理分级比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1各组大鼠食管黏膜病理改变分级（略）

　　2.2血清MDA含量和SOD、GSHPx活性

　　与假手术组比较，模型组大鼠血清MDA含量增加，SOD和GSHPx活性下降，差异有统计学意义（P<0.01）；各治疗组MDA含量和SOD、GSHPx活性与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）；调中颗粒组与西沙必利组、半夏泻心汤组比较，调中颗粒组SOD、GSHPx活性升高，差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）；调中颗粒组MDA含量低于西沙必利组（P<0.05），但与半夏泻心汤组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。表2各组大鼠血清MDA含量以及SOD和GSHPx活性（略）

　　2.3食管黏膜中PCNA和p53阳性物质表达

　　与假手术组比较，模型组PCNA和p53表达增多，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，各治疗组PCNA和p53的表达降低（P<0.01）。与西沙必利组比较，调中颗粒组PCNA和p53的表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）。半夏泻心汤组PCNA和p53的表达高于调中颗粒组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、图3和表3。表3各组大鼠食管黏膜中PCNA和p53的表达（略）

RE是由胃和十二指肠内容物，主要是酸性胃液或酸性胃液加胆汁反流至食管所引起的食管黏膜的炎症、糜烂等病变。长期反复反流还可导致食管溃疡、BE和EAC等，这些病变的主要表现为黏膜上皮细胞增生过度及异常，与局部生成过多的氧自由基，出现氧化应激，导致基因突变密切相关［4］。正常的食管鳞状上皮细胞大多数处于静止状态，各种反流物对食管黏膜的刺激损伤导致氧化应激活跃，产生大量氧自由基，攻击生物膜形成一系列脂质过氧化产物及其降解产物MDA等，从而启动内源性酶类抗氧化剂SOD和GSHPx的清除机体自由基、中和与减轻活性氧毒性的功能［5］。本实验结果显示模型组大鼠MDA含量增加，SOD和GSHPx活性下降，这可能是胃十二指肠内容物反流造成食管黏膜损伤导致氧化应激活跃的结果。调中颗粒可明显降低血中MDA的含量，且作用优于西沙必利（P＜0.05），同时还可提高SOD和GSHPx的活性，且作用优于半夏泻心汤（P＜0.05）。这可能与其组方有关。

调中颗粒是在半夏泻心汤的基础上加减而成的经过临床验证的有效中药制剂，以姜半夏为君，降逆之功极佳，臣以炮姜、黄芩、黄连辛开苦降，佐以太子参、大枣甘温益气，以恢复气机升降功能和机体抗邪能力，又加入杏仁、厚朴苦温下气，助肺气肃降以利胃气和降。因此调中颗粒可能是通过降逆而减少内容物的反流，减弱氧化应激活动，从而提高组织局部抗氧化能力而发挥黏膜保护作用。