中药软肝饮对CCl4诱导的肝纤维化大鼠TGF

【摘要】［目的］研究中药软肝饮对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝脏TGF-1及Smad3，Smad7表达的影响，探讨其抗纤维化的作用机制。［方法］Wistar大鼠40只，随机分成正常对照组，模型对照组，软肝饮治疗组，鳖甲软肝片对照组，采用CCl4背部皮下注射构建肝纤维化模型，行HE和VG染色，光镜下观察肝组织肝纤维化程度。同时免疫组化SABC方法检测各组TGF-1、Smad3和Smad7的表达。［结果］与正常对照组相比，模型组TGF-1、Smad3表达明显增强，Smad7表达明显下降。经软肝饮治疗后大鼠肝脏TGF-1表达比模型组减弱。软肝饮同时下调Smad3的表达，上调Smad7的表达。另外，软肝饮组大鼠肝脏病理变化显著改善。［结论］肝炎平对大鼠肝纤维化肝脏TGF-1/Smad信号通路有明显的影响，能抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化，其作用机制可能为抑制TGF-1表达，下调Smad3及上调Smad7的表达。

【关键词】软肝饮；TGF-1/Smad信号通路；肝纤维化

　　Abstract:［Aim］TostudytheeffectsofRuanganyinonTGF-1，Smad3，Smad7expressionsoftheexperimentalhepaticfibrosisinducedbycarbontetrachloride（CCl4）inrats，andtoexploreitsanti-fibroticmolecularmechanism.［Method］FortyhealthyWistarratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup，vacantcontrolgroup，CCl4-inducedhepaticfibrosisgroup，andRuanganyintreatedgroup.Theratsinnormalgroupweretreatedwithnormalsalinebyintragastricalirrigation，andtheothergroupsweresubcutaneousinjectedwithCCl4toestablishhepaticfibrosismodel.Thehistologicalchangesofthelivertissueswereexaminedbypathologicalexamination.Theproteinexpressionoftransforminggrowthfactorbeta1（TGF-1）andSmad3,Smad7weremeasuredbyimmunohistochemicaltechnique.［Result］Incomparisonwiththoseinmodelgroup，thelevelsofTGF-1weresignificantlydecreasedaftertreatmentwithRuanganyin.Meanwhile，thelevelsofSmad3wasalsodown-regulated.However，thelevelofSmad7expressionwassignificantlyup-regulated.ThepathologicalchangesoflivertissuesinRuanganyingroupswerealsomarkedlyalleviated.［Conclusion］RuanganyinhassignificantinhibitoryeffectsonCCl4-inducedhepaticfibrosisinrats，anditsmechanismmaybeassociatedwiththeinhibitionofTGF-1expression，down-regulationofSmad3expressionandup-regulationofSmad7expression.

　　Keywords:Ruanganyin；TGF-1/Smadsignalingpathway；hepaticfibrosis

肝纤维化（hepaticfibrosis，HF）是多种原因引起的慢性肝损伤的共同病理改变，其特征是纤维增生和降解不平衡，纤维组织在肝脏过度沉积的结果［1］。研究证实，肝星状细胞（hepaticstellatecells，HSC）活化和转型在肝纤维化中发挥关键作用，HSC的激活在HF发生、发展中处于中心地位［2-3］。而TGF-b是促进肝纤维化发展的最重要的细胞因子之一,它可与肝星状细胞表面的受体结合,通过激活Smad通路,从而促进胶原等细胞外基质的合成和分泌［4］。Smad家族是TGF-b1细胞内传导的通道，有研究发现［5-6］TGFb-Smad信号转导通路在肝纤维化的发生发展中起着重要的作用，软肝饮的抗纤维化作用亦可能与TGF-1/Smad信号通路有关，为了探讨其抗肝纤维化作用的机制，我们采用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，用免疫组化方法检测TGF-1、Smad3、Smad7的表达，观察软肝饮对肝纤维化时肝脏TGF-1/Smad信号通路的影响。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　动物：同一品系清洁级健康Wistar大鼠40只，雄性，质量（130～150g）及普通饲料均由安徽中医学院实验动物中心提供。药品和主要试剂：（1）软肝方（组成:鳖甲50g、黄芪50g、柴胡25g、丹参50g、川芎34g、莪术34g）由本院药剂科提供，临用前用双蒸水稀释成不同浓度备用。（2）CCl4，购自南京建成生物有限公司（批号：10006418）。（3）鳖甲软肝片由内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产（批号：20061106），研制成粉末，双蒸水溶解成含药1ml/100g（0.6g/kg）混悬液。（4）TGF-1、Smad3、Smad7免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。（5）花生油，购自超市。

　　2.2.1分组

　　将40只Wistar大鼠（雄性、体重量130～150g）随机分成4组:正常对照组10只,CCl4肝纤维化模型组10只，软肝饮治疗组10只，阳性（鳖甲软肝片）对照组10只。

　　2.2.2动物模型制备

　　将CCl4与高压灭菌花生油按1：9比例配成10%油剂，第1～4周，除正常组外，其他各组大鼠按0.5ml/100g背部皮下注射10%CCl4花生油溶液，每周两次。5～13周，正常组和CCl4肝纤维化模型组给予生理盐水，软肝饮组大鼠每天给予软肝饮灌胃1次,剂量为2.0g/kg大鼠体重（相当于临床用药量的16倍）。阳性对照组每天给与鳖甲软肝片1ml/100g（0.6g/kg）灌胃1次。各组动物每周称重一次，根据体重变化调整给药量。第13周末，末次给药24h后，全部大鼠股动脉放血处死,留取血液及全部肝脏,每只大鼠取相同部位肝脏用10%中性甲醛固定,剩余-80°C低温冰箱保存;血液1500rpm离心后取血清置于-80°C低温冰箱保存。