梗阻性肾病细胞凋亡的药物调控研究进展

　　Progressinresearchondrugmodulationofapoptosisinobstructivenephropathy　　所有的梗阻性肾病不论梗阻发生在泌尿道的何处，最终都可因梗阻导致的一系列复杂的损伤反应引发不可逆的肾间质纤维化和肾小管萎缩，从而导致肾功能不全或高血压。而在此病理生理过程中，肾细胞凋亡起着异常重要的作用。细胞凋亡的异常主要包括间质成纤维细胞的凋亡减少［1］（但仅就肾间质细胞总体而言，此时其细胞凋亡也是增加的，只是程度比小管细胞小［2］）和肾小管（尤其是远端小管）上皮细胞（renaltubularepithelialcells，RTE）的凋亡增加［3］，分别对应着形态学上的肾间质纤维化和肾小管扩张、萎缩。动物实验已经证实甚至在输尿管梗阻解除后，肾小管细胞的凋亡仍会继续加剧［4，5］。故能够调控肾细胞凋亡特别是抑制肾小管上皮细胞凋亡的药物，就极可能对梗阻性肾病尤其是梗阻解除后肾功能继续恶化者具有实际的治疗作用［6］。近年来，随着对梗阻性肾病发病的细胞和分子机制的深入了解，这方面的研究有了较大进展。许多药物的作用正是针对梗阻性肾病已知的发病环节，对药物作用机制的研究又促进了对梗阻性肾病发病机制的更深的了解。　　目前梗阻性肾病细胞凋亡的药物调控治疗尚处于实验阶段，多用于单侧输尿管梗阻（UUO）的动物模型或体外培养的肾小管上皮细胞或成纤维细胞。现根据已试验过的药物种类及作用机制对有关进展作一综述。　　1生长因子类物质及其拮抗剂　　Walton等［7］于1992年发现单侧输尿管完全梗阻动物患肾中表皮生长因子（EGF）mRNA的表达及EGF蛋白水平在梗阻发生后迅速下降，自72h就已几乎检测不到，而转化生长因子-β（TGF-β）mRNA的表达却有明显增加。已知EGF具有很强的促进RTE细胞有丝分裂的作用，从而可使RTE细胞复制增加，梗阻肾EGF的急剧下降可能是RTE细胞凋亡的重要启动因素之一。肾固有细胞或侵袭肾脏的巨噬细胞所产生的TGF-β是梗阻性肾病间质纤维化发生的关键性的分子介质，TGF-β通过与肾素-血管紧张素系统的复杂作用，能刺激成纤维细胞增生，细胞外基质（ECM）的分泌增加，并促使上皮细胞转化为肌成纤维细胞，而后者在ECM聚积和肾间质纤维化方面所起的作用更大［2］。Kennedy等［8］发现在给左侧输尿管完全结扎的成年大鼠注射重组EGF后，在显著抑制了RTE细胞凋亡的同时也促进了细胞的再生，显示阻止硫糖蛋白-2（SGP-2）表达可能是EGF的作用机制之一，而SGP-2是肾梗阻基因激活的重要产物和肾细胞凋亡启动的生物标记之一。Chevalier等［9］则发现注射重组EGF［0.1mg.（kg・d）］使UUO新生大鼠RTE细胞的增生增加了76%，凋亡减少了80%，同时还降低了波形蛋白（Vimentin）、SGP-2及TGF-β1蛋白表达。EGF治疗使肾小管的扩张降低了50%，萎缩降低了30%，而间质纤维化也降低了50%。这一研究显示补充较低剂量的EGF即可在很大程度上缓解UUO导致的新生动物RTE细胞凋亡，其效果明显比成年动物好。　　胰岛素样生长因子-1（IGF-1）已被证明可以缓解缺血性急性肾衰竭引起的肾损伤。Chevalier等［10］随后证实了IGF-1可使UUO新生大鼠患肾RTE细胞的凋亡减少38%～50%，同时也使间质的胶原沉积减少了约44%。MizunoS等［11］证实补充外源性的肝细胞生长因子（HGF）可以减缓UUO动物RTE细胞的凋亡;GaoX等［12］用基因疗法提高了动物梗阻肾HGF的表达，结果成功地抑制了RTE细胞的凋亡。Nguyen等［13］的研究表明肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF）在凋亡启动过程中有细胞保护作用。　　既然TGF-β是梗阻性肾病发病机制中的关键因素之一，Miyajima等［15］研究了TGF-β的单克隆抗体（1D11）对被机械拉伸力作用后的肾小管上皮细胞（NRK-52E）及患UUO大鼠的作用，结果显示机械拉伸导致NRK-52E细胞的显著凋亡，同时伴随着TGF-β的释放增多;1D11（10mg.mL）完全能抑制拉伸引起的凋亡;而对照组梗阻肾内TGF-β的浓度较未梗阻组高20倍，1D11抑制了梗阻肾组织中TGF-β的生成。1D11不但能减缓梗阻肾间质纤维化和小管细胞凋亡，还能显著促进RTE细胞的增生。1D11在减少梗阻肾p53表达的同时，能提高bcl-2水平;且总一氧化氮合成酶（NOS）活性与诱生性一氧化氮合成酶（iNOS）活性均有所升高。此项研究提示TGF-β的抗体是一种极有前途的预防UUO引起的肾小管纤维化及凋亡的药物。Miyajima等［15］还发现抗过敏药物曲尼司特（Tranilast）可以显著减少UUO14d小鼠RTE细胞的凋亡达1倍以上，并且可促进其增殖。因为曲尼司特给药组组织中的TGF-β的水平仅为未给药组的1.5左右，故Miyajima等推测曲尼司特的抗凋亡作用可能是通过减少组织中TGF-β来实现的。Miyajima等［16］还发现环氧化酶-2（COX-2）抑制剂依托度酸（Etodolac）具有曲尼司特相似的作用。其他药物如吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）可抑制环孢素A诱导的RTE细胞凋亡［17］，但其对梗阻肾RTE细胞凋亡的作用目前尚无研究。Decorin是肾内天然存在的两种硫酸皮肤素蛋白多糖之一，其核心蛋白能够与TGF-β结合，并使之失效，具有较强的抗纤维化作用［18］，缺乏Decorin会导致UUO动物RTE细胞凋亡增多［19］。美国Tellos公司已获准将重组Decorin投入Ⅰ期临床实验。

　　2血管紧张素拮抗剂　　肾素-血管紧张素系统（RAS）在梗阻性肾病中起着关键性的作用。血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）如依那普利（Enalapril）或血管紧张素Ⅰ（AT1）受体特异性阻断剂如氯沙坦（Losartan）已经证实可以减缓输尿管梗阻引起的肾间质纤维化及肾小管上皮细胞凋亡。这种作用与药物干扰了输尿管梗阻时血管紧张素Ⅱ（AngII）介导的TGF-β与Fas配基（FasL）基因的表达有关，而与Fas基因无关［20，21］。而替米沙坦（Telmis-artan）的抗凋亡作用还与其抑制了炎症的过氧化反应有关［22］。Morrissey等［23］则发现AngII受体拮抗剂PD-123319抑制了UUO大鼠RTE细胞的凋亡，同时也降低了肾间质α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，为肾间质纤维化的重要标记物）的表达，其作用与p53的表达受到抑制有关。　　3一氧化氮合成酶促进剂　　一氧化氮（NO）由NOS（包括诱生性和组织固有性NOS）通过精氨酸合成而来。NO在输尿管梗阻引起的肾间质纤维化及肾小管上皮细胞凋亡的过程中起着重要作用。iNOS基因缺失小鼠（iNOS-.-）在UUO后较同种野生型小鼠有更严重的肾皮质变薄及间质纤维化，其肾组织中的TGF-β水平也较野生型小鼠明显为高［24］。但Huang等［25］在进行了更为深入的研究之后发现，在给UUO的iNOS基因缺失小鼠补充一氧化氮合成的前体L-精氨酸后，其患肾皮质变薄的情况并未如预料中的得到改善，反而更加恶化。Huang等认为，这意味着在调节梗阻性肾病间质纤维化方面，组织固有性的NOS如内皮或神经元固有的NOS可能较iNOS更为重要。Miyajima等［26］利用流式细胞学方法分析了NO对受到机械力量拉伸的RTE细胞株（NRK-52E）的作用，结果显示增加培养基NO的浓度后，由拉伸引起的NRK-52E细胞凋亡减少，相反当加入NOS抑制剂后，这种细胞凋亡就增加。Miyajima等进一步对比研究了iNOS基因缺失小鼠（iNOS-.-）及其同种野生型小鼠发生UUO的情况。UUO发生14d后，iNOS-.-小鼠梗阻肾的小管细胞凋亡较野生型的小鼠为多。显然NO在机械拉伸和UUO引起的RTE凋亡均起到了保护性作用。ItoK等［27］为已解除输尿管梗阻的动物日常补充L-精氨酸，结果RTE细胞的进行性凋亡大大缓解。　　4天然药物提取物　　Jones等［21］利用UUO大鼠模型研究了类黄酮类药物姜黄（Curcumin）、槲皮素（Quercetin）对凋亡及炎症基因表达的作用。结果显示姜黄和槲皮素治疗组的单核细胞趋化蛋白-Ⅰ（MCP-1）的表达水平较对照组显著下降，和未治疗的对照组相比，槲皮素能显著抑制Fas基因的表达，FasL的检出水平则在所有治疗组都有减少;姜黄治疗组血红素加氧酶-1（HO-1）的表达增加了4倍。类黄酮类药物可能通过改变这些基因的表达从而有益于保护肾脏。近年研究发现，中药丹参、大黄素（大黄主要活性成分）均能通过抑制成纤维细胞增殖和促进其凋亡而发挥抗纤维化作用，但作用机制尚需进一步探讨［28，29］。张国强等［30］观察了三七总苷（PNS）对体外培养的人肾间质成纤维细胞凋亡及其调控蛋白C-Myc、Fas表达的影响作用，结果证实PNS可促进成纤维细胞凋亡，导致细胞生存数量下降，其机制可能与PNS诱导C-Myc蛋白表达上调有关，而与Fas蛋白无关。郝丽娜等［31，32］的研究也显示PNS中含量最高的成分人参皂苷Rg1对梗阻肾小管和间质细胞凋亡有不同的作用，其机制与Bcl-2.Bax系统有关。　　5其他　　YukawaK等［33］报告信号传导及转录激活子6（STAT6）的缺失增加了肾细胞的凋亡和肾间质纤维化。Hruska等［34］报告了在UUO发生后给予成骨蛋白-1（OP-1），肾间质的炎症和成纤维过程可被抑制，在梗阻发生后的开始5d内保存了肾功能。和依那普利相比，OP-1在预防小管间质纤维化和保护肾功能方面更为有效。与依那普利主要对肾间质成分发挥作用不同，OP-1是通过保持小管上皮细胞的完整性、防止肾小管萎缩而起到保护肾脏的作用的。这种保护作用的实现关键在于OP-1阻断了UUO引起的RTE细胞凋亡过程。Chan等［35］在用成年大鼠代替新生大鼠建立UUO解除后（RUUO）的动物模型时，研究了α-生育酚对此种模型的作用，结果发现UUO解除同时加行对侧健康肾脏切除（RUUO+NX）的动物模型患病肾脏内增高的TGF-β1mRNA水平在7d后仅有部分下降，但在梗阻解除后持续给予α-生育酚治疗14d后，TGF-β1mRNA的水平较未治疗组有了显著的下降，同时患病肾脏RTE细胞凋亡和热休克蛋白-70（HSP-70）免疫染色水平的变化与TGF-β1mRNA的变化是平行的。另外，α-生育酚的治疗显著的缓解了梗阻解除后仍在继续发展的肾纤维化过程，降低了患病肾脏重量与体重之比。这些研究数据证明了α-生育酚对RUUO后持续发展的肾损伤具有治疗作用。HegartyNJ等［36］发现用内皮素受体阻滞药波生坦（Bosentan）可有效减少实验动物梗阻肾小管细胞的凋亡。MiyajimaA［37］等用NF-κB活化抑制剂DHMEQ（dehydroxymethylepoxyquinom-icin）也得到了相似的效果。另外最近的研究表明调节血脂药阿伐他汀（Atorvastatin）、氟伐他汀（Fluvastatin）也能抑制实验动物梗阻肾小管细胞的凋亡［38，39］。