关键词：
弓形虫病 StatusintheresearchofnucleicacidvaccineagainsttoxoplasmainChina.
刚地弓形虫（简称弓形虫）呈世界性分布，哺乳动物及鸟类普遍易感。人类对弓形虫有较强的自然免疫力，感染后绝大多数无明显症状表现，或只出现亚急性弓形虫病。但在孕妇及免疫功能低下者（如ADIS病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等）感染弓形虫后引起的危害严重。人体弓形虫感染日益受到关注，弓形虫病疫苗成为当前研究的热点。动物实验发现，弓形虫全虫疫苗，弓形虫特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染度作用，但前者可能会引起再感染，后者的免疫保护效果较差。弓形虫病核酸疫苗克服了上述疫苗存在的不足，具有良好的开发应用前景。我国从上世纪90年代后期开始了弓形虫病核酸疫苗的研制，通过对表达保护性抗原蛋白基因进行重组，先后研制出弓形虫基因单价疫苗、复合疫苗和混合疫苗。动物实验证明部分疫苗具有良好的免疫预防效果。
1保护性抗原及目的基因研究
弓形虫裂殖了表面膜蛋白（SAG）［1，2］，致密颗粒蛋白（GRA）［3］和棒状体蛋白（ROP）［4］是重要的弓形虫抗原，这些抗原物质与弓形虫的侵袭性有关，且能诱导宿主的免疫反应。
1.1SAGSAG是弓形虫裂殖子表面膜蛋白。通过对SAG的分子结构、生物学和免疫学特性研究发现，有5种（分别命名为P22、P23、P30、P35利P43）与弓形虫病免疫有关。
1.1.1P30（SAGl）P30分子质量30～35kDa含量约占虫体总蛋白的3%～5%，主要存在于弓形虫表膜及内膜系统，也可分泌到虫体外环境。P30是重要的弓形虫表面膜蛋白，与虫体的吸附和入侵有关，能被弓形虫急性感染期及恢复期血清抗体识别。动物实验证明，用纯化的P30蛋白免疫小鼠可显著提高小鼠抗弓形虫感染能力［5］。为提高免疫效果，于瑾等［6］构建了含有
霍乱毒素A2/B亚基基因和P30基因的重组表达质粒，转化宿主菌BL2l后经IPTG诱导产生30-CTA2/B融合蛋白。游东生等［7］将P30重组表达质粒转化入DH5α，Westernblot证明IPTG诱导表达的P30抗原分子能被抗弓形虫血清识别。
1.1.2P22（SAG2）SAG2是一个基因家族，包括SAG2B、SAG2C和SAG2D。其中SAG2B表达于速殖子表面，而SAG2C和SAG2D仅表达于缓殖子的表面。研究证明，P22蛋白参与弓形虫的入侵过程，并且与弓形虫速殖子向缓殖子的转化有关。P22的抗原性较弱，但仍能提高免疫动物的免疫水平。姚永伟等［8］用PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P22基因编码序列，克隆入载体pET-32a，转化大肠埃希菌BL2l，IPTG诱导的表达产物能被兔抗弓形虫血清识别。龙彩虹等［9，10］构建的P22重组质粒转化宿主菌的IPTG诱导表达产物也被证明具有良好的抗原性。
1.1.3P35研究发现，P35蛋白的C端区（201～225及301～340号氨基酸）具有高亲水性，利用蛋白质分析软件分析P35基因编码的氨基酸序列，发现其编码的氨基酸序列含有多个T、B淋巴细胞表位，证明P35蛋白具有抗原性。林敏等［11］采用RT-PCR技术从弓形虫cDNA文库中扩增出编码P35抗原的基因片段，构建了弓形虫RH株表面抗原P35基因重组表达质粒P35/pGEX-21，并在大肠杆菌JMl09中成功表达了分子质量为70kDa融合蛋白，该蛋白能为谷胱甘肽S转移酶（GST）单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。
1.1.4P23与其它弓形虫表面腆蛋白不同，P23不是GPI锚定蛋白，P23的N端连接有糖基化位点，是慢性弓形虫病的一个分子标志。疫苗研究发现，24kDa的多肽物质能诱导产生一定的免疫保护力。用24kDa多肽免疫动物后，在该动物血液中检测到了抗P23抗体［12］。闪此认为P23可能包含该多肽的免疫表位，其基因序列可能存在同源性。是有希望的弓形虫病疫苗候选基冈。
1.2GRA弓形虫致密颗粒秆放多种蛋白（GRA），已经报道的有8种，其中研究较多的有GRAl、GRA4、GRA6手GRA8。
1.2.1GRAlGRAl是慢性弓形虫病的标志性抗原分子。研究表明，GRAl可诱导免疫动物产生以IFN-R升高为特征的保护性细胞免疫应答。彭碧云等［13］将构建的GRAl基因重组质粒用脂质体介导，转染到小鼠巨噬细胞RAW264.7，光学显微镜观察形态学改变并绘制生长曲线。结果证明重组质粒的表达产物使巨噬细胞增殖能力增强。贾雪梅等［14］利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRAl基因片段，成功构建了pEGFP-N3-GRAl真核表达重组质粒。
1.2.2GRA4GRA4蛋白分子质量为40kDa，存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡中，当速殖子分裂并侵入细胞时GRA4被分泌到细胞外，刺激机体免疫系统产生粘膜免疫及全身免疫。林绮萍等［15］根据GRA4基因序列，设计并合成PCR引物，扩增弓形虫GRA4基因片段，成功构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-GRA4，该重组子在大肠杆菌中经IPTG诱导，表达分子质量为60.3kDa的融合蛋白，该蛋白能与免抗弓形虫血清发生反应。
1.2.3GRA6GRA6分子存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡，与裂殖子的入侵有关。朱翔等［16］采用聚合酶链反应从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，导入表达载体PGEX-5X-3，然后在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RP中进行表达。经SDS-PAGE鉴定表达产物分子质量为49kDa，能被感染弓形虫者特异性IgM和IgG血清所识别。
1.2.4GRA7GRA7为分子质量29kDa的致密颗粒蛋白，在弓形止速殖子、包囊及肠内期虫体均有分布。PCR分析表明，不同地理株弓形虫GRA7基因均具有保守性［17］。重组表达质粒pGEX-4T―I/GRA7转入大肠埃希菌BL21后经IPTG诱导，表达的GST融合蛋白具有GRA7的抗原性［18］。
1.2.5GRA8一般认为，GRA8分子为弓形虫致密颗粒分泌蛋白。但Beghetto等［19］报道GRA8可能是P35。为研究GRA8的抗原性和制备高效的弓形虫核酸疫苗，袁仕善等［20］参照GRA8序列设计引物，采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出编码GRA8的基因片段，分别亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，经SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明致密颗粒抗原GRAS的原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白，分子质量为41kDa:用提纯的真核重组表达质粒免疫小鼠（后腿肌肉注射，每周1次，每次50μg，连续2周），4周后检测证实免疫鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体，ELSA滴度1:100。杨慧龄等［21］构建的pcDNA3.1（+）-GRA8重组质粒经PCR鉴定利测序分析，与GENEBANK相应基因序列完全一致。
1.3ROP弓形虫棒状体可分泌棒状体蛋白（ROP），这些蛋白物质的产生与弓形虫入侵宿主细胞有关。已报道的棒状体蛋白有8种，国内研究较多的为ROP1利ROP2。
1.3.1ROP1ROP1蛋白为单拷贝的ROP1基因表达产物，该蛋白物质能影响宿主细胞的通透性。杨秋林等［22］根据ROP1基因的碱基序列没计引物，从已构建的cDNA文库中筛选出了编码ROP1基因的cDNA片段，得到分子质量为70kDa的GST-ROP1重组蛋白，经鉴定该融合蛋白大小与预测值相符。
1.3.2ROP2ROP2是一种保守蛋白，含有能被多个免疫个体所识别的T细胞表位，在弓形虫速殖子期、缓殖子期及包囊期表达的ROP2分广均能诱导宿主产生对弓形虫感染的免疫应答，主要表现为T细胞的增生和IFN-R的产生，是重要的疫苗候选因子。吴乩等［23］根据ROP2基因已知序列，设计合成一对PCR引物，从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段，再克隆到pGEX-4T-1质粒并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行ITPG诱导表达。经SDS-PAGE分析，ROP2基因PCR产物大小与预期相符约1043bp，测序结果与已知序列基本吻合:免疫印迹显示表达产物具抗原性。
2弓形虫病核酸疫苗研究
2.1单基因疫苗
2.1.1P30基因疫苗占国清等［24］用大量制备的重组真核表层质粒pBK-P30，经生理盐水稀释至1μg/μl，1次肌注免疫BALB/c小鼠，通过测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率及CD4+、CD8+T细胞亚群变化观察弓形虫表面抗原P30DNA疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫应答。结果免疫组小鼠CD8+细胞数量升高，CD4+/CD8+比率下降。表明弓形虫表面抗原P30DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答。龚娅等［25］利用PCR技术和亚克隆技术分别构建了弓形虫表膜型P30基因重组质粒（个完整的P30编码序列，包括信号肽）pcDNA3-P30In，并将以上3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠，之后的免疫检测证明3种表达形式的重组质粒均能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体，虽然膜型及分泌型免疫鼠特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠，但4周后的抗体水平3组间差异无显著性。
2.1.2P22基因疫苗P22分子的抗原性引起了研究者的重视，P22基因已成为弓形虫疫苗研究的热点。高世同等［26，27］用构建的pVAXl-SAG2真核表达质粒接种小鼠后，用RT-PCR方法从注射部位肌肉组织总RNA中扩增出SAG2目的基因条带;免疫小鼠血CD4+细胞数升高，并检测到血清抗弓形虫特异性IgG抗体。证明构建的SAG2真核表达重组质粒pVAXl-SAG2能在小鼠肌肉中转录表达P22蛋白，可诱导产生细胞免疫与体液免疫应答。龙彩宏等［28］将构建的真核表达重组质粒pVAXl-SAG2在质脂体介导下转染Vero细胞，Westenblot分析细胞裂解液样品有1条约17kDa大小的条带可被弓形虫免疫血清所识别。而高世桐等［29］构建的Pbk-P22基因重组表达质粒转化宿主菌后的诱导表达产物分子质量为28kDa，能被弓形虫感染猪血清抗体识别。由于所选择的质粒pBK-CMV既是原核表达质粒又是真核细胞表达载体，含有CMV真核表达启动子，因此认为所构建的pBK-P22表达质粒可能是一种理想的弓形虫DNA疫苗。
2.2复合基因苗
2.2.1P30-P22复合基因疫苗单价疫苗显示了一定的免疫效果，但仍不能满足设计要求。为增强核酸疫苗的免疫效果，李瑛等［30］将弓形虫表面抗原P22、P30的有效基因片段同构建在同一克隆载体pUCl9和表达载体pGEMEXTM-1上，并保证其连接方向及开放读码框的正确。古饮民等［31］用IPTG诱导含有P22、P30复合基因的重组菌表达融合蛋白，并进行了免疫活性检测。结果在66.5kDa位置的融合蛋
白带可与P30抗体特异结合，表明质粒重组体表达的融合蛋白与P30的抗原性相同。孙怡等［32］将构建的PCDNA3.1-P30-P22质粒通过肌内注射直接免疫小鼠，观察其诱导的体液免疫应答及保护性作用。结果免疫组小鼠血清抗体水平显著升高，攻击感染后小鼠存活时间显著延长。证明重组真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22经肌注即可诱导小鼠产生体液免疫应答，并能抵抗弓形虫感染。
2.2.2P30-ROPl复合基因疫苗蒋华等［33］将弓形虫P30基因片段和俸状体蛋白（ROP2）的基因片段重组入pUCl8克隆载体，再将酶切的P30-ROP2外源基因片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体，成功获得pUCl8-P30-ROP2重组质粒。陈海峰等［34］用构建的SAGl和ROPl复合基因真核表达质粒接种小鼠，观察诱导产生的拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫。抗体及细胞因子检测结果表明，SAGl和ROPl复合基因疫苗诱导小鼠产生了很强的体液免疫和细胞免疫，接种该疫苗对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用。杨亭亭等［35］用构建的弓形虫SAGl-ROP2复合基因疫苗免疫小鼠后，观察了血中及T淋巴细胞变化。结果显示，免疫鼠血中和CD8+细胞数均高于用pcDND-SAGl重组质粒免疫鼠，免疫鼠感染弓形虫后的平均生存时间为（9.5±1.25）d，而用弓形虫pcDND-SAGl重组质粒免疫鼠感染弓形虫后的平均生存时间为（7±0.89）d，差异有显著性（P<0.05）。认为弓形虫SAGl-ROP2复合基因疫苗的免疫效果较好。
2.3混合基因疫苗HbsAg是乙型
肝炎疫苗的理想候选分子，能有效保护机体免受乙型肝炎病毒感染。HbsAg同时又是理想的基因工程疫苗的载体，在不同部位插入外源基因，能表达相应的HbsAg融合蛋白。HbsAg的佐剂作用能显著提高疫苗的免疫效果。王丹静等［36］将构建的pcDNA3-HBsAg-GRAl质粒经脂质体转染体外培养的COS-7细胞，转染后的细胞培养上清经SDS-PAGE，Western-blot鉴定证明，转染的细胞能高效表达分子质量为47kDa的分泌性融合蛋白（HBsAg-GRAl），该蛋白能同时被HBsAb阳性者血清及弓形虫免疫兔血清识别。霍乱毒素（CT）是常用的粘膜免疫佐剂，具有较强的粘膜免疫原性和佐剂放应，不仅能增强抗原的免疫原性，同时增强机体的免疫反应。丛华等［37］用构建的SAGl、SAG2和霍乱毒A2/B亚基基因真核重组质粒经后腿肌肉免疫BALB/C小鼠，每2周注射1次，每次100μg质粒。与不含A2/B亚基的P30-P22复合基因疫苗比较，用混合基因疫苗免疫3次后的小鼠血清抗体水平升高，脾淋巴细胞的增殖活性（体外淋巴细胞转化率）及NK细胞活性显著增强，免疫鼠感染弓形虫后的存活时间延长。说明A2/B亚基能有效增强弓形虫DNA疫苗的免疫效果。
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