关键词：
弓形虫病 StatusintheresearchofnucleicacidvaccineagainsttoxoplasmainChina.
刚地弓形虫（简称弓形虫）呈世界性分布，哺乳动物及鸟类普遍易感。人类对弓形虫有较强的自然免疫力，感染后绝大多数无明显症状表现，或只出现亚急性弓形虫病。但在孕妇及免疫功能低下者（如ADIS病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等）感染弓形虫后引起的危害严重。人体弓形虫感染日益受到关注，弓形虫病疫苗成为当前研究的热点。动物实验发现，弓形虫全虫疫苗，弓形虫特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染度作用，但前者可能会引起再感染，后者的免疫保护效果较差。弓形虫病核酸疫苗克服了上述疫苗存在的不足，具有良好的开发应用前景。我国从上世纪90年代后期开始了弓形虫病核酸疫苗的研制，通过对表达保护性抗原蛋白基因进行重组，先后研制出弓形虫基因单价疫苗、复合疫苗和混合疫苗。动物实验证明部分疫苗具有良好的免疫预防效果。
1保护性抗原及目的基因研究
弓形虫裂殖了表面膜蛋白（SAG）［1，2］，致密颗粒蛋白（GRA）［3］和棒状体蛋白（ROP）［4］是重要的弓形虫抗原，这些抗原物质与弓形虫的侵袭性有关，且能诱导宿主的免疫反应。
1.1SAGSAG是弓形虫裂殖子表面膜蛋白。通过对SAG的分子结构、生物学和免疫学特性研究发现，有5种（分别命名为P22、P23、P30、P35利P43）与弓形虫病免疫有关。
1.1.1P30（SAGl）P30分子质量30～35kDa含量约占虫体总蛋白的3%～5%，主要存在于弓形虫表膜及内膜系统，也可分泌到虫体外环境。P30是重要的弓形虫表面膜蛋白，与虫体的吸附和入侵有关，能被弓形虫急性感染期及恢复期血清抗体识别。动物实验证明，用纯化的P30蛋白免疫小鼠可显著提高小鼠抗弓形虫感染能力［5］。为提高免疫效果，于瑾等［6］构建了含有
霍乱毒素A2/B亚基基因和P30基因的重组表达质粒，转化宿主菌BL2l后经IPTG诱导产生30-CTA2/B融合蛋白。游东生等［7］将P30重组表达质粒转化入DH5α，Westernblot证明IPTG诱导表达的P30抗原分子能被抗弓形虫血清识别。
1.1.2P22（SAG2）SAG2是一个基因家族，包括SAG2B、SAG2C和SAG2D。其中SAG2B表达于速殖子表面，而SAG2C和SAG2D仅表达于缓殖子的表面。研究证明，P22蛋白参与弓形虫的入侵过程，并且与弓形虫速殖子向缓殖子的转化有关。P22的抗原性较弱，但仍能提高免疫动物的免疫水平。姚永伟等［8］用PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P22基因编码序列，克隆入载体pET-32a，转化大肠埃希菌BL2l，IPTG诱导的表达产物能被兔抗弓形虫血清识别。龙彩虹等［9，10］构建的P22重组质粒转化宿主菌的IPTG诱导表达产物也被证明具有良好的抗原性。
1.1.3P35研究发现，P35蛋白的C端区（201～225及301～340号氨基酸）具有高亲水性，利用蛋白质分析软件分析P35基因编码的氨基酸序列，发现其编码的氨基酸序列含有多个T、B淋巴细胞表位，证明P35蛋白具有抗原性。林敏等［11］采用RT-PCR技术从弓形虫cDNA文库中扩增出编码P35抗原的基因片段，构建了弓形虫RH株表面抗原P35基因重组表达质粒P35/pGEX-21，并在大肠杆菌JMl09中成功表达了分子质量为70kDa融合蛋白，该蛋白能为谷胱甘肽S转移酶（GST）单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。
1.1.4P23与其它弓形虫表面腆蛋白不同，P23不是GPI锚定蛋白，P23的N端连接有糖基化位点，是慢性弓形虫病的一个分子标志。疫苗研究发现，24kDa的多肽物质能诱导产生一定的免疫保护力。用24kDa多肽免疫动物后，在该动物血液中检测到了抗P23抗体［12］。闪此认为P23可能包含该多肽的免疫表位，其基因序列可能存在同源性。是有希望的弓形虫病疫苗候选基冈。
1.2GRA弓形虫致密颗粒秆放多种蛋白（GRA），已经报道的有8种，其中研究较多的有GRAl、GRA4、GRA6手GRA8。
1.2.1GRAlGRAl是慢性弓形虫病的标志性抗原分子。研究表明，GRAl可诱导免疫动物产生以IFN-R升高为特征的保护性细胞免疫应答。彭碧云等［13］将构建的GRAl基因重组质粒用脂质体介导，转染到小鼠巨噬细胞RAW264.7，光学显微镜观察形态学改变并绘制生长曲线。结果证明重组质粒的表达产物使巨噬细胞增殖能力增强。贾雪梅等［14］利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRAl基因片段，成功构建了pEGFP-N3-GRAl真核表达重组质粒。
1.2.2GRA4GRA4蛋白分子质量为40kDa，存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡中，当速殖子分裂并侵入细胞时GRA4被分泌到细胞外，刺激机体免疫系统产生粘膜免疫及全身免疫。林绮萍等［15］根据GRA4基因序列，设计并合成PCR引物，扩增弓形虫GRA4基因片段，成功构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-GRA4，该重组子在大肠杆菌中经IPTG诱导，表达分子质量为60.3kDa的融合蛋白，该蛋白能与免抗弓形虫血清发生反应。
1.2.3GRA6GRA6分子存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡，与裂殖子的入侵有关。朱翔等［16］采用聚合酶链反应从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，导入表达载体PGEX-5X-3，然后在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RP中进行表达。经SDS-PAGE鉴定表达产物分子质量为49kDa，能被感染弓形虫者特异性IgM和IgG血清所识别。
1.2.4GRA7GRA7为分子质量29kDa的致密颗粒蛋白，在弓形止速殖子、包囊及肠内期虫体均有分布。PCR分析表明，不同地理株弓形虫GRA7基因均具有保守性［17］。重组表达质粒pGEX-4T―I/GRA7转入大肠埃希菌BL21后经IPTG诱导，表达的GST融合蛋白具有GRA7的抗原性［18］。
1.2.5GRA8一般认为，GRA8分子为弓形虫致密颗粒分泌蛋白。但Beghetto等［19］报道GRA8可能是P35。为研究GRA8的抗原性和制备高效的弓形虫核酸疫苗，袁仕善等［20］参照GRA8序列设计引物，采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出编码GRA8的基因片段，分别亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，经SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明致密颗粒抗原GRAS的原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白，分子质量为41kDa:用提纯的真核重组表达质粒免疫小鼠（后腿肌肉注射，每周1次，每次50μg，连续2周），4周后检测证实免
