体内和体外实验观察骨形成蛋白在骨肉瘤中的作用

作者：岳文　杨连甲　马明　董绍忠　文章来源：口腔颌面外科杂志　

　　摘　要：目的　研究骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）在骨肉瘤中的表达及其与肿瘤增殖活性的关系，并观察BMP单抗体外对骨肉瘤细胞作用，为骨肉瘤的单抗治疗打下基础。方法　应用BMP单抗和免疫组化方法检测骨肉瘤中BMP蛋白的表达；并应用增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的单抗对骨肉瘤的增殖活性进行检测；体外实验观察BMP单抗对骨肉瘤细胞OS-732的作用。结果　24例标本中有18例有BMP蛋白的表达；有BMP表达的骨肉瘤有较高的增殖活性；应用BMP单抗体外可以对骨肉瘤细胞系OS-732细胞产生生长抑制。结论　BMP有可能在肿瘤的发生和发展过程中起一定作用，可以作为估计骨肉瘤预后的参考指标，BMP单抗对骨肉瘤细胞的抑制作用为其临床应用于骨肉瘤的单抗治疗打下基础。　　骨肉瘤恶性程度高，极易发生转移，现在的治疗方法主要是手术治疗和化疗，术后5年生存率仅为20%左右。目前尚无较好指标判断骨肉瘤的生物学特征及其预后。骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）最早由冻干骨肉瘤组织中提取，因其可以在体内诱导异位骨的形成而得名。BMP在骨肉瘤中有较为丰富的表达并影响肿瘤的生物学特征。本实验利用BMP的单克隆抗体检测骨肉瘤中BMP蛋白的表达，观察BMP和骨肉瘤细胞增殖活性间的关系以明确BMP在肿瘤中的作用，为BMP单抗应用于骨肉瘤治疗的研究打下基础。　　1　材料和方法　　1.1　标本来源　　所有标本来源于第四军医大学口腔医学院手术切除并经病理诊断证实为骨肉瘤的标本（1996～1997年）。标本总例数为24例，患者平均年龄26.5岁。标本中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续组织切片，厚度5μm。　　1.2　免疫组化　　BMP单抗（BMP-McAb）为本教研室制备，工作浓度为1∶50。增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的单克隆抗体为PC10，购至DAKO公司，工作浓度为1∶50。ABC试剂盒购至Vector公司。常规免疫组化方法染色，DAB显色，设已知有BMP和PCNA表达的软骨肉瘤标本为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。BMP的阳性反应为细胞浆或骨基质的棕黄色着色，PCNA的阳性反应为细胞核的棕黄色着色。BMP和PCNA反应的阳性判断标准为高倍镜（×40）中有10个以上的阳性细胞。PCNA的阳性反应分级参照文献［1］。　　1.3　BMP-McAb对骨肉瘤细胞的体外作用　　人成骨肉瘤细胞OS-732由北京积水潭医院提供，经免疫组化鉴定有BMP的表达。选用不同浓度的BMP-McAb作用于OS-732细胞，以PBS代替一抗作阴性对照，采用噻唑兰活细胞染色法检测BMP-McAb的细胞毒作用，根据所测A490nmOD值计算BMP-McAb对细胞的杀伤率，公式如下：　1.4　检验方法　　χ2检验，t检验　　2　结　果　　2.1　免疫组化检测结果　　24例骨肉瘤标本中可见18例（75%）有BMP的阳性表达，多边形、梭形的肿瘤细胞胞浆及未钙化的肿瘤性骨基质中均可见到BMP反应的棕黄色着色（图1）。但对于已钙化的骨基质未见BMP的存在。　　2.2　BMP表达与PCNA反应间的关系　　PCNA的阳性反应为胞核的棕黄色着色（图2）。骨肉瘤的表达与PCNA的表达如表1。经校正χ2检验，P＜0.05，差异具有显著性，可以认为有BMP表达者有较高的PCNA反应。　　2.3　BMP-McAb对OS-723细胞的作用　　BMP-McAb对OS-732细胞的48h连续作用后的结果见表2。由此推算出的杀伤率（见图3）。t检验分析表明加药组和不加药组之间有差异（P＜0.01）。可以认为BMP-McAb对OS-723细胞的生长有抑制作用。在浓度2.5mg/ml至2.5×10-5mg/ml之间有明显的浓度-效应关系。表1　BMP表达与PCNA反应间的关系BMP例数PCNA表达　　（-～PCNA表达　　（+18711-642表2　BMP-McAb细胞毒实验结果抗体浓度（mg/ml）OS-732细胞A490nmoD值2.50000.4000±0.03610.25000.5675±0.03610.02500.6500±0.04240.00250.6650±0.01730.000250.6625±0.0330　0.0000250.6825±0.0330空白对照0.7308±0.0198本新闻共2页,当前在第1页12

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