眼睑皮肤恶性黑色素瘤早期检测进展

【摘要】　　眼睑皮肤恶黑瘤发病率低，预后差，在临床及病理上很难与其他肿瘤鉴别。本文回顾了国内外眼睑皮肤恶黑瘤相关基因、肿瘤标志物的文献，发现B-RAF、hTERT、NOS及melan-A均与眼睑皮肤恶性黑色素瘤发生、发展，早期检测相关，有利其鉴别诊断。

【关键词】眼睑　恶性黑色素瘤　基因　早期检测

　　Theadvancesonearlydetectionofeyelidmalignantmelanoma

AbstractEyelidmalignantmelanomaisrarebuthasagraveprognosis.Itisverydifficulttodifferentiateeyelidmalignantmelanomaandothertumorsinclinicalandpathological.Studiesonthecorrelatedgenes,tumormarkersineyelidmalignantmelanomasarereviewedinthepresentpaper.TheresultsshowB-RAF,hTERT,NOSandmelan-Acontributedtotheeyelidmalignantmelanomasinonset,progressandearlydetectionwhichareadvantageousfordifferentialdiagnosis.

・KEYWORDS:eyelid;malignantmelanoma;gene;earlydetection

眼睑皮肤恶黑瘤占眼睑肿瘤不到1%，占眼睑恶性肿瘤5.4%，发生率在我国居眼睑恶性肿瘤第4位，近年呈增加趋势。目前眼睑皮肤恶黑瘤的诊断即肿瘤病理活检及黑素细胞抗体HMB45，S-100蛋白免疫组化分析。近年肿瘤研究不断深入，更多肿瘤标志物、相关基因开始用在眼睑皮肤恶黑瘤的早期检测中。

1B-RAF与眼睑皮肤恶黑瘤

Raf是一类进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是Raf-Ras-MEK-ERK-MAPK（MEK:mitogen/extracecullarsignal-regulatedkinase;ERK:extracecullarsignal-regulatedkinase;MAPK:mitogen-activatedproteinkinase）信号转导途径中的重要成员，在细胞增殖、分化、生长、及凋亡中起重要的调控作用。B-RAF原癌基因又名鼠类肉瘤滤过性毒菌（V-Raf）致癌同源体B1，受其上游RAS蛋白激酶的调控，为脊椎动物细胞中Raf家族成员，它可通过其mRNA的不同剪接产生大小不同的分子，行使不同功能。通过对肿瘤细胞株基因组DNA突变筛选后证明B-RAF原癌基因在60%以上的恶性黑色素瘤及少数的肠癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中都有突变[1]。曾有试验将突变的B-RAF基因转染到黑色素细胞中，使其表型发生恶性转变，将该细胞株接种到裸鼠体内，发现其呈侵袭性生长，并导致肿瘤形成[2]。所有的B-RAF原癌基因突变都限定于激酶结构域内，主要突变发生在15（89%）外显子上，其中约92%位于第1799核苷酸上，导致其编码的谷氨酸被缬氨酸取代（V600E），此种错义突变使B-RAF激酶活性发生改变，持续激活ERK、MEK和MAPK通道，使前有丝分裂原有效分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化，从而形成肿瘤。ERK被激活后活性增加，促进细胞增殖和侵袭、改变整合素的表达、降低E-钙黏素表达及增加基质金属蛋白酶（MMP）分泌[3]。采用特异性MEK激酶抑制剂阻断B-RAF突变引起的下游信号通路的激活，如口腔内给药CI1040就能有效抑制鼠的恶黑瘤肺转移，并能使已产生的肺转移灶缩小甚至消失[4]。而MAPK通路的激活被认为是促进细胞非控制性的分裂，它通过传递胞外分裂信号在黑色素瘤细胞增殖过程中扮演重要角色。MAPK信号传递抑制剂如LeTx（炭疽致死毒素）及小分子MAPK激酶抑制剂均能触发人黑色素瘤细胞凋亡[2]。

有学者通过研究spitzoid黑色素病变中B-RAF,N-RAS,和H-RAS3种基因的表达，发现spitzoid恶黑瘤及其转移癌中均有86%发生B-RAF或N-RAS变异，疑为恶黑瘤的色素性病变中35%存在B-RAF或N-RAS的变异，Spitz痣和非典型Spitz痣中均未发现3种基因的变异。Spitz痣和非典型Spitz痣及疑为肿瘤的病变中测到H-RAS变异率各为29%、14%及7%，spitzoid恶黑瘤中表达阴性。因此提示鉴别诊断良恶性spitzoid黑色素病变中B-RAF及相关基因变异分析可作为辅助诊断工具[5]。而Uribe等[6]认为B-RAF变异在良性和非典型黑素细胞痣及恶黑瘤三者中的表达并无统计学意义，且其变异情况与恶黑瘤Clark's分级无关。现有资料表明B-RAF突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关，可能是一种新的恶性肿瘤相关基因，新的基因治疗靶点。但对B-RAF突变的研究只有短时间几年研究，尚缺乏大规模、系统而深入的研究，仍有较多有争议的问题需进一步阐明。

2人端粒酶逆转录酶（hTERT）与眼睑皮肤恶黑瘤

端粒是位于真核细胞染色体末端，由串联排列的重复DNA序列和端粒结合蛋白构成的特殊结构，在染色体复制及保护染色体稳定中起重要作用。正常人类体细胞每分裂一次丢失50～200bp，端粒缩短到一定程度后，细胞就会衰老死亡。端粒酶为一具有逆转录酶活性的核糖核蛋白体，以自身RNA组分为模板，逆转录合成端粒的重要序列，加入到缩短了的端粒中去补偿细胞分裂时染色体末端端粒的缩短，维持其原有长度使细胞“永生化”[7]。对人类来说，端粒酶活性出现在大多数胚胎组织，正常成年男性生殖细胞、炎性细胞、更新组织的增生细胞及大多数肿瘤细胞。端粒酶由人端粒酶RNA（hTR）,端粒酶相关蛋白（TP1/TLP1）和人端粒酶催化亚单位/人端粒酶逆转录酶（hTRT/hTERT）3个亚单位组成。到现在为止，hTERT在大部分恶性肿瘤中表达，在正常组织（除生殖细胞和有高度复制潜能的体细胞）中不表达。而其他两种成分在肿瘤组织和正常组织中均有不同程度的表达[8]。曾有试验研究hTR及hTERT各自在乳腺癌、甲状腺癌及恶黑瘤中的表达，表明只有hTERT可作为肿瘤患者血浆中一非特异性肿瘤标志物[9]。

据报道端粒酶在消化、泌尿、血液、呼吸等系统肿瘤细胞中表达均呈阳性，从良性痣到非典型痣再到恶黑瘤及转移性恶黑瘤其活性持续增高，活性高低与肿瘤分化程度，临床分期密切相关[10]，且与hTERT阳性表达显著正相关，受hTERT转录和选择剪接的调节控制[11]。现认为端粒酶可用于肿瘤筛查，判定肿瘤恶性程度及患者预后[7]，hTERT的检测可作为端粒酶活性研究指标[12]。国内研究显示hTERT阳性表达随黑素细胞良恶性变化而逐渐增加，hTERT阳性细胞也见于良性黑素细胞，说明端粒酶激活只代表细胞增生活跃或获得一定程度永生化能力，但不是恶性肿瘤特有，当该酶激活能力很高达一定阈值，细胞才获得永生化能力发展为恶性肿瘤[13]。各种痣中hTERT阳性细胞可能已具有进一步演变为恶黑瘤的潜能，追踪hTERT阳性痣病变患者将有助于早期发现恶黑瘤，提示对hTERT检测在恶黑瘤早期检测方面具有良好临床应用前景[14]。但有报道hTERT仍不能作为原发黑色素病变的辅助组织学诊断，其原因尚不清楚[15]。

3一氧化氮合酶NOS与眼睑皮肤恶黑瘤

一氧化氮NO主要在体内参与血管舒张、神经递质转导、巨噬细胞介导细胞毒等多功能调节，介导DNA损伤参与早期肿瘤形成过程，通过刺激肿瘤细胞侵袭性，诱导血管生成，调节免疫系统而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。它由一氧化氮合酶NOS家族合成，包括神经型NOS（nNOS）,内皮型NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）。前两者主要分布在神经组织和血管内皮，产生短时效、少量NO，作为神经递质和调节局部血流。后者主要由巨噬细胞产生，产生长时效、大量NO，具有多种不同功能。