医学论文,细胞周期G₁/S转换调控因子在喉癌癌变过程中的表达

细胞周期G1/S转换调控因子在喉癌癌变过程中的表达

肿瘤防治杂志2000年第4期第17卷基础研究

作者：王金泉　王建波　娄卫华　董明敏

单位：王金泉　王建波　娄卫华　董明敏（河南医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科　郑州市　450052）

关键词：喉肿瘤；p21WAF1/CIP1基因；p53基因；细胞周期蛋白D1；免疫组织化学

　　【摘要】目的：探讨喉癌癌变过程中p21WAF1/CIP1、p53和cyclinDl表达的临床病理学意义。方法：用免疫组化检测20例正常粘膜、40例不典型增生病变和60例喉癌组织中p21WAF1/CIP1、p53和cyclinDl表达。结果：①p21WAF1/CIP1、p53和cyclinDl阳性表达定位于细胞核；②在喉癌癌变过程中，喉正常粘膜、不典型增生病变和喉癌中p21WAF1/CIP1阳性表达率分别为95.0%（19/20），75.0%（30/40）和63.3%（38/60）（P＜0.05）；p53阳性表达率分别为：0%、30.0%（12/40）和61.7%（37/60）（P＜0.001）；cyclinDl阳性表达率分别为5.0%（1/20）、30.0%（12/40）、53.3%（32/60）（P＜0.001）；③p21WAF1/CIP1在高、中和低分化的喉癌中阳性表达率分别为76.2%（16/21）、65.5%（19/29）和30.0%（3/10）（P＜0.05）；④cyclinDl和p21WAF1/CIP1阳性表达显著相关，p21WAF1/CIP1和p53表达无相关性。结论：①喉癌癌变过程中p53和cyclinDl阳性表达率呈逐渐升高的趋势，而p21WAF1/CIP1阳性表达率呈逐渐降低的趋势；②p53和cyclinDl异常表达是喉癌发生中早期分子事件；③p21WAF1/CIP1表达与喉癌细胞分化程度有关；④细胞周期调控因子p21WAF1/CIP1、p53和cyclinDl相互调控机制在喉癌发展中起重要作用。

　　中图分类号：R739.65；R730.231　　文献标识码：A

　　文章编号：1009-4571（2000）04-0356-04

ExperssionofG1/STransitionRegulatorsinLaryngealSquamousCellCarcinogeneses

WANGJin-quan，WANGJian-bo，LOUWei-hua

　　（DepartmentofOtorhinolarygology,JiningFirstPeople′sHospital,Shandong.Jining272111）

　　【Abstract】Objective:Toinvestigatetheclinicopathlogicalsignificanceofthep21WAF1/CIP1,p53andcyclinD1expressioninlaryngealcarcinogeneses.Mithods:Theexpressionofp21WAF1/CIP1，p53andcyclinDlwereexaminedbyimmunohistochemistrymethodinnomalepithlia（20）,dysplasticepithlia（40）andlaryngealcancers（60）.Results:①Immunoreactiontop21WAF1/CIP1，p53andcyclinDlwaslocalizedinthenucleiofcells.②Innomalepithlium,dysplasticsquamorsepithlirmandinsquamouscellcarcinomaofthelarynx,thepositiveimmunostainingrateofp21WAF1/CIP1Proteinwas95.0%（15/20）,75.0%（30/40）and63.3%（38/60）respectively（P＜0.05），p53proteinwas0%，30.0%（12/40）and61.7%（37/60）respectively（P＜0.01）,cyclinDlpriteinwas5.0%（1/20）,30.0%（12/40）and53.3%（32/60）respectively（P＜0.01）.③p21WAF1/CIP1positiveexpressioninhighly、moderatelyandpoorlydifferentiatedcarcinomaswere76.2%（16/21），66.5%（19/29）and30.0%（3/10）respectively（P＜0.05）.④Thepositiveexpressionofp21WAF1/CIP1closelyrelatedwiththepositiveexpressionofCyclinDl（P＜0.05）.Nocorrelationwasfoundbetweenp21WAF1/CIP1andp53（P＜0.01）.Conclusions:①Withthedevelopmentoflesionsthepositiveimmunostainingrateofp53andcyclinDlp21WAF1/CIP1proteinwasdecreasing.②p53andcyclinDlcouldbeearlymoleculareventsinthecarcinogenesisoflarynx.③p21WAF1/CIP1expressiomisassociatedwithtumourcelldifferentiation.④Themutualmechanismofcellcycleregulatorsplaysanimportantroleinthelaryngealcarcinoma.

　　【Keywords】laryngealneoplasm;p21WAF1/CIP1gene;p53gene;cyclinDlprotein;lmmnuohistochemistry

　　研究证实，细胞周期调控异常是肿瘤发生发展的内在原因。Sherr［1］提出细胞在G1/S期转换中存在着一个重要的调控点，它决定着细胞是否进入S期进行DNA合成。为此，许多学者陆续发现大量的癌基因、抑癌基因和生长因子都是通过作用于G1期而发挥其调控功能的。p21WAF1/CIP1和p53是细胞周期调控的重要的负性调控因子，细胞周期蛋白（cyclinD1）是正性调控因子。本实验以喉正常粘膜、喉粘膜不典型增生病变和喉癌为研究对象，采用免疫组化方法检测3种基因蛋白产物，观察在喉癌癌变过程中的变化及相互关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　喉癌60例，喉粘膜不典型增生病变组40例，正常粘膜20例。

　　1.2　方法

　　按免疫组化SP法试剂盒提供说明进行，免疫组化检测设阳、阴性对照。参考文献［2，3］确定本实验结果的判断标准：p21WAF1/CIP1、p53和cyclinD1阳性反应均为棕黄色颗粒，定位于细胞核。以细胞核出现棕黄色颗粒作为阳性细胞：阴性（-）：无阳性细胞或阳性细胞数＜5%；阳性（+）：阳性细胞数≥5%。

　　2　结果

　　2.1　喉癌中p21WAF1/CIP1、p53和cyclinD1阳性细胞的表达

图1　p21WAF1/CIP1在喉癌中的阳性表达，SP法×350；

图2　p53在喉癌中的阳性表达，SP法×350；

图3　CyclinD1在喉癌中的阳性表达，SP法×350；

　　CyclinD1阳性细胞以散在分布于喉癌组织内

　　2.2　3种基因蛋白产物在喉癌癌变过程中的表达

　　p21WAF1/CIP1在喉正常粘膜、喉不典型增生病变和喉癌中阳性表达分别为95%（19/20）、75.0%（30/40）和63.3%（38/60），喉癌组明显低于对照组（P＜0.05）。p53在喉癌癌变中阳性表达率分别为：0%、30.0%（12/40）和61.7%（37/60）；CyclinD1的阳性表达率分别为5.0%（1/20）、30.0%（12/40）和53.3%（32/60），喉癌组明显高于对照组（P＜0.001）。

　　2.3　3种基因蛋白表达与临床病理参数的关系　

　　p21WAF1/CIP1在高、中、低分化的喉癌中阳性表达率呈逐渐下降的趋势，高分化组明显高于低分化组（P＜0.05）。p21WAF1/CIP1、p53和cyclinD1阳性表达率与喉癌的性别、临床分型、T分型和临床分期差异无显著性，P＞0.05（表1）。

表1　喉癌中p21WAF1/CIP1、p53表达、cyclinD1与临床病理参数的关系

　　注：※χ2=6.34，P＜0.05。2.4　3种基因蛋白表达的相关性分析

　　60例喉癌中，p21WAF1/CIP1与p53二者共同阳性23例，共同阴性8例，相关性分析P＞0.05。p21WAF1/CIP1与cyclinD1二者共同阳性24例，共同阴性14例，相关性分析P＜0.05。

　　3　讨论

　　p21WAF1/CIP1基因直接参与细胞生长抑制、DNA复制、发育和分化等调控过程，与肿瘤的发生发展机制密切相关［4］。本实验中，p21WAF1/CIP1基因蛋白阳性表达率在喉癌癌变过程中呈逐渐降低趋势，由于p21WAF1/CIP1是1种罕见突变的肿瘤抑制基因［5］，免疫组化检出的p21WAF1/CIP1均有生物学功能，本实验结果提示p21WAF1/CIP1基因在喉癌癌变过程中，其蛋白表达水平的降低参与喉癌的发生。研究表明，p21WAF1/CIP1阳性表达与肿瘤细胞分化有关［6］。本实验发现喉癌中，高、中、低分化组p21WAF1/CIP1阳性表达率呈逐渐降低的趋势，高分化组明显低于低分化组。表明p21WAF1/CIP1阳性表达与喉鳞状上皮细胞癌分化程度有关，与文献［6］结果一致。p53基因突变是肿瘤发生的原因之一。野生型p53基因为肿瘤抑制基因，其蛋白半衰期较短，免疫组化难于检测；该基因突变失活后，表达产物稳定性增强，并失去正常的抑制作用，免疫组化易于检测。本实验所采用DO-7单抗主要检测突变型p53，结果显示：在喉癌癌变过程中，p53阳性表达率喉癌组明显高于对照组；而且p53表达与临床分期、细胞分化程度、肿瘤的部位无关。提示p53基因异常在喉癌形成过程中起重要作用，其异常表达出现在喉癌发生早期阶段，与文献报道［6］相符。

　　cyclinD1是参与细胞周期C1/S转换的重要正性调节因子。它们过度表达使细胞周期G1/S转换时间缩短，进而促进细胞周期的进程和细胞的过度增殖，导致细胞癌变。研究表明，免疫组化法检测cyclinD1蛋白表达可以反映其基因的扩增和mRNA过表达的水平［7］。因此，通过免疫组化法探讨喉癌发生发展的不同阶段（正常→不典型增生病变→原发性肿瘤），可有助理解cyclinD1在喉癌发生发展中的作用。本实验发现：喉癌癌变过程中cyclinD1阳性表达率呈逐渐升高的趋势，喉癌组明显高于对照组；cyclinD1蛋白表达不仅出现在肿瘤细胞，而且在不同程度的不典型增生病变中也有表达，并且cyclinD1阳性表达与喉癌细胞分化程度、临床分型、T分期和临床分期无相关性；说明cyclinD1的阳性表达在一部分喉癌的发生过程中起重要作用。结果表明，cyclinD1基因蛋白的表达可能是喉癌发生过程中的一个较早的分子事件［3］。

　　研究表明，p21WAF1/CIP1诱导表达存在依赖p53和不依赖p53表达的2条途径［2，6，8］。本文结果显示：p21WAF1/CIP1和p53阳性表达无相关性。在非小细胞肺癌中也证实p21WAF1/CIP1表达不依赖于p53基因或蛋白的改变［8］。提示：喉癌中p21WAF1/CIP1诱导表达存在不依赖p53的途径，而且在喉癌发展中可能起重要作用。

　　研究表明，DNA损伤因子导致p53表达增高，通过诱导其下游靶基因p21WAF1/CIP1的表达，抑制cyclinD1-CDK4/6复合物活性，反馈诱导cyclinD1的表达［9］。本实验发现p21WAF1/CIP1与cyclinD1表达显著相关。说明在喉癌发生发展过程中可能存在因p21WAF1/CIP1诱导cyclinD1表达途径，提示喉癌中cyclinD1阳性表达，除基因扩增外，p21WAF1/CIP1诱导途径也可能是其表达的重要机制之一。与乳腺癌［10］的研究结果一致。

　　总之，细胞周期调控因子相互调控机制在喉癌演进过程中起重要作用。

　　参考文献：

　　［1］SherrCJ,RobertsJM.InhibitorsofmammalianGlcyclin-dependentkinaes.GenesDevelop［J］,1995,9:1149～1163.

　　［2］ElisPA,LonningPE,Borresen-DaleA,etal.Absenceofp21expressionisassociatedwithabnormalp53inhumanbreastcarcinomous［J］.BrJCancer,1997,76:480～485.

　　［3］FracchiollaSN,PruneriG,PignataroL,etal.Molecularandommunohistochemicalanalysisofthebcl-1/cyclinD1geneinlaryngealsquamous［J］.Cancer,1997,79:1114～1122.

　　［4］HartwellLH,KastamMB.Cellcyclecontrolandcancer［J］.Science,1994,266:1821～1828.

　　［5］ShioharaM,El-DeingWS,WadaW,etal.Absenceofwaflmutationinavarietyofhumanmalignancies［J］.Blood,1994,84;3781～3784.

　　［6］NadalA,JaresP,CazorlaM,etal.p21WAF1/CIP1expressionisassociatedwithcelldifferentitionbutnotwithp53mutationsinsquamorscellcarcinomasoflarynx［J］.JPathol,1997,183;156～163.

　　［7］CapaccioP,PruneroG,CarboniN.CyclinDlproteinexpressionisrelatedtoclinicalprogressioninlaryngealsquamouscellcarcinomas［J］.JournalofLaryngologyandOtology,1997,11:622～632.

　　［8］MarchettiA,DoglionpC,BarbareschiM,etal.p21RNAandproteinexpressioninnon-smallcelllungcarcinomas:evidenceofp53indepentexpressionandassociationwithtumoraldifferentiation［J］.Oncogene1996,12:1319～1324.