急性甲醇中毒大鼠模型及其眼部改变的研究

Abstract：ObjectiveTodeveloparatmodelmanifestingacutemethanolpoisoningandstudytheocularchangessoastolayfoundationsforfurtherinvestigationofvisualimpairment.MethodsThirty-twoSDratswererandomlydividedintogroupA，B，CandD.GroupAandBwereexposedtoamixtureofN2O/O2andgivendifferentdosageofmethanolbygavage.GroupCwasexposedtoN2O/O2andgiventhesamevolumeofsalineasgroupB.GroupDwasexposedtonormalairandgiventhesamedosageofmethanolasgroupB.Generalcondition，ocularchanges，methanolconcentrationinvenousblood，electroretinogramandretinalhistopathologicchangeswereanalyzed.ResultsMethanol-intoxicatedratswerecharacteristicbyslowreaction，incoordination，opticdischyperemiaandedemaandretinalhaemorrhage.BodymasslosswassignificantingroupAandBwhencomparedwithgroupCandD，whichwasginAandginB，respectively.A-waveandb-waveofelectroretinogramweremarkedlyreducedingroupAandB，whichwasμVandμVingroupA，andμVandμVingroupB，respectively.Retinaledema，derangementofcellsandvacuoleswereobviousunderlightmicroscope.Changesunderelectromicroscopewerecharacteristicbycellapoptosis，mitochondriaswollen，andcristaedisruption.ThesechangesweremoreobviousingroupB.ConclusionAcutemethanolpoisoninginratscouldbesuccessfullyduplicatedbyexposuretoamixtureofN2O/O2methanoladministrationbygavage，withtypicalretinalstructuralandfunctionalchanges.

Keywords：methanol;acutepoisoning;ratmodel;gavage

甲醇是一种无色、有毒的挥发性液体，可经呼吸道、胃肠道和皮肤吸收进入人体而中毒。近年因饮用假酒致急性甲醇中毒的事件时有发生，随着甲醇在人们生产、生活中应用日益广泛，其意外中毒的可能性不断增加。中毒后幸存者常遗留不同程度的视觉损害，而目前甲醇致视功能损害的机理尚未明确，国内仅见临床病例道，缺乏相关的实验研究。国外研究采用的大鼠种属在我国并不普及，在建模方法、染毒剂量、评价指标等方面缺乏系统性及可比性。本研究采用SD大鼠，设立不同剂量甲醇灌胃组，借鉴人类急性甲醇中毒的诊断标准制订该模型的评价指标，探讨其眼部结构和功能改变，较系统地建立了急性甲醇中毒的大鼠模型，为今后进一步研究视功能损害机理及救治方法打下基础。

1材料和方法

1.1主要试剂与仪器

分析纯甲醇，以生理盐水稀释成质量浓度为30％的甲醇溶液；40L压缩N2O∶O2混合气体；4％多聚甲醛、苏木素、伊红；2.5％戊二醛、1％四氧化锇；枸橼酸钠抗凝管、生理盐水；NEUROPAKⅡ电生理检查仪，Stemi2000-C显微镜，H-600透射电镜。

1.2实验动物分组及模型建立

健康SPF级雄性SD大鼠32只，体质量200~220g，用随机数排序法分为4组，每组8只。A组：低剂量甲醇组；B组：高剂量甲醇组；C组：生理盐水对照组；D组：空气对照组。从灌胃前4h起至实验结束，A、B、C组大鼠均置于一密闭有机玻璃箱中，以2L/min的速度通入N2O∶O2混合气体，D组大鼠置于正常空气中。开始通气时间定为0h，分别在第4，24，48h给各组大鼠灌胃，A组：首次甲醇灌胃剂量为2g/kg，其后每次1g/kg；B组：首次剂量4g/kg，其后每次2g/kg；C组：与B组等体积的生理盐水代替甲醇灌胃；D组：按B组剂量给予甲醇灌胃。第60小时停止通气，作各项指标检测。

1.3模型的评价指标及方法

1.3.1全身及眼部的中毒表现观察甲醇灌胃后大鼠的反应、活动、意识状态、体质量变化；裂隙灯观察眼前节改变；直接眼底镜观察眼底等的改变。

1.3.2视网膜电图检测于第60小时取出大鼠暗适应4h，复方托品酰胺散瞳，氯胺酮50mg/kg、氯丙嗪25mg/kg混合腹腔注射，丁卡因表麻，NeuropackⅡ电生理仪检测视网膜电图，记录I16单次白光刺激下a波、b波潜伏期及振幅。所有操作均在有微弱红光照明的暗室内进行，未检查眼用不透光黑布遮盖避光，角膜电极、参考电极和地电极分别置于角膜表面、舌下和尾部。

1.3.3静脉血甲醇浓度的检测ERG检查结束后，从右心房抽取静脉血2mL注入枸橼酸钠抗凝管中充分振荡，采用顶空气相色谱法检测血中甲醇浓度。

1.3.4视网膜组织学检查断颈法处死大鼠，迅速摘除双眼球，解剖显微镜下分离视网膜，固定于4％多聚甲醛中48h，按常规制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察。

1.3.5视网膜超微结构检查按上述方法分离出1mm×5mm大小视网膜组织，PBS漂洗，固定于2.5％戊二醛4℃冰箱过夜，次日1％四氧化锇后固定2h，丙酮系列脱水，Epon812定向包埋制成超薄切片，醋酸双氧铀γ柠檬酸铅双染色，透射电镜下观察。