急性甲醇中毒大鼠模型及其眼部改变的研究

【摘要】【目的】探讨急性甲醇中毒大鼠模型的制作方法及其眼部改变，为研究中毒后视功能损害及救治方法建立基础。【方法】sd大鼠32只，随机分为a（低剂量甲醇组）、b（高剂量甲醇组）、c（生理盐水对照组）、d（空气对照组）4组，每组8只。a、b组吸入n2o/o2混合气及不同剂量甲醇灌胃，c组吸入n2o/o2混合气及生理盐水灌胃，d组置于正常空气中并按b组剂量给予甲醇灌胃，观察各组大鼠一般情况、体质量及眼部改变、静脉血甲醇浓度、视网膜电图和视网膜组织学改变。【结果】染毒大鼠反应迟钝、运动失调，视盘充血水肿、视网膜点状出血，a组大鼠体质量为（187±12）g，b组为（176±13）g，较c、d对照组显著减轻（p<0.05）；a组视网膜电图a、b波振幅分别为（87±13）μv、（187±38）μv，b组a、b波振幅分别为（53±19）μv、（132±39）μv，与对照组相比明显下降（p<0.05）；视网膜在光镜下表现为各层细胞水肿、排列紊乱及空泡化；电镜下细胞凋亡，线粒体肿胀、嵴断裂；b组动物上述改变尤其明显。【结论】吸入n2o/o2混合气及甲醇灌胃可建立急性甲醇中毒的大鼠模型，出现典型的视网膜结构和功能改变。

【关键词】甲醇；急性中毒；大鼠模型；灌胃

ratmodelofacutemethanolpoisoningwithocularchanges

shejie-ting1,zhangshao-chong1,chengjian-xin2,lengyun-xia1

（1.statekeylaboratoryofophthalmology//zhongshanophthalmiccenter,sunyat-senuniversity，guangzhou

510060,china;2.departmentofophthalmology,thetwelfthpeople’shospitalofguangzhou,guangzhou510080,china）

abstract:【objective】todeveloparatmodelmanifestingacutemethanolpoisoningandstudytheocularchangessoastolayfoundationsforfurtherinvestigationofvisualimpairment.【methods】thirty-twosdratswererandomlydividedintogroupa（lowmethanoldosagegroup,n=8）,b（highmethanoldosagegroup,n=8）,c（salinecontrolgroup,n=8）andd（aircontrolgroup,n=8）.groupaandbwereexposedtoamixtureofn2o/o2andgivendifferentdosageofmethanolbygavage.groupcwasexposedton2o/o2andgiventhesamevolumeofsalineasgroupb.groupdwasexposedtonormalairandgiventhesamedosageofmethanolasgroupb.generalcondition,ocularchanges,methanolconcentrationinvenousblood,electroretinogramandretinalhistopathologicchangeswereanalyzed.【results】methanol-intoxicatedratswerecharacteristicbyslowreaction,incoordination,opticdischyperemiaandedemaandretinalhaemorrhage.bodymasslosswassignificantingroupaandbwhencomparedwithgroupcandd（p<0.05）,whichwas（187±12）ginaand（176±13）ginb,respectively.a-waveandb-waveofelectroretinogramweremarkedlyreducedingroupaandb（p<0.05）,whichwas（87±13）μvand（187±38）μvingroupa,and（53±19）μvand（132±39）μvingroupb,respectively.retinaledema,derangementofcellsandvacuoleswereobviousunderlightmicroscope.changesunderelectromicroscopewerecharacteristicbycellapoptosis,mitochondriaswollen,andcristaedisruption.thesechangesweremoreobviousingroupb.【conclusion】acutemethanolpoisoninginratscouldbesuccessfullyduplicatedbyexposuretoamixtureofn2o/o2methanoladministrationbygavage,withtypicalretinalstructuralandfunctionalchanges.

keywords:methanol;acutepoisoning;ratmodel;gavage

[jsunyat-senuniv（medsci）,2007,28（6）:636-640]

甲醇（methanol,ch3oh）是一种无色、有毒的挥发性液体，可经呼吸道、胃肠道和皮肤吸收进入人体而中毒。近年因饮用假酒致急性甲醇中毒的事件时有发生，随着甲醇在人们生产、生活中应用日益广泛，其意外中毒的可能性不断增加。中毒后幸存者常遗留不同程度的视觉损害，而目前甲醇致视功能损害的机理尚未明确，国内仅见临床病例报道[1]，缺乏相关的实验研究。国外研究采用的大鼠种属在我国并不普及，在建模方法、染毒剂量、评价指标等方面缺乏系统性及可比性[2]。本研究采用sd大鼠，设立不同剂量甲醇灌胃组，借鉴人类急性甲醇中毒的诊断标准制订该模型的评价指标，探讨其眼部结构和功能改变，较系统地建立了急性甲醇中毒的大鼠模型，为今后进一步研究视功能损害机理及救治方法打下基础。

1材料和方法

1.1主要试剂与仪器

分析纯甲醇（广州化学试剂厂），以生理盐水稀释成质量浓度为30％的甲醇溶液；40l压缩n2o∶o2混合气体（1∶1，广州气体厂）；4％多聚甲醛、苏木素、伊红（中山眼科中心病理室提供）；2.5％戊二醛、1％四氧化锇（中山大学医学院电镜室提供）；枸橼酸钠抗凝管、生理盐水；neuropak电生理检查仪（日本光电公司），stemi2000-c显微镜（德国zeiss），h-600透射电镜（日本hitachi）。

1.2实验动物分组及模型建立

健康spf级雄性sd大鼠32只（广东省医学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2005a010），体质量200~220g，用随机数排序法分为4组，每组8只。a组：低剂量甲醇组；b组：高剂量甲醇组；c组：生理盐水对照组；d组：空气对照组。从灌胃前4h起至实验结束，a、b、c组大鼠均置于一密闭有机玻璃箱中，以2l/min的速度通入n2o∶o2混合气体，d组大鼠置于正常空气中。开始通气时间定为0h，分别在第4，24，48h给各组大鼠灌胃，a组：首次甲醇灌胃剂量为2g/kg，其后每次1g/kg；b组：首次剂量4g/kg，其后每次2g/kg；c组：与b组等体积的生理盐水代替甲醇灌胃；d组：按b组剂量给予甲醇灌胃。第60小时停止通气，作各项指标检测。

1.3模型的评价指标及方法

1.3.1全身及眼部的中毒表现观察甲醇灌胃后大鼠的反应、活动、意识状态、体质量变化；裂隙灯观察眼前节改变；直接眼底镜观察眼底等的改变。

1.3.2视网膜电图检测于第60小时取出大鼠暗适应4h，复方托品酰胺散瞳，氯胺酮50mg/kg、氯丙嗪25mg/kg混合腹腔注射，丁卡因表麻，neuropack电生理仪检测视网膜电图（electroretinogram,erg），记录i16单次白光刺激下a波、b波潜伏期及振幅。所有操作均在有微弱红光照明的暗室内进行，未检查眼用不透光黑布遮盖避光，角膜电极、参考电极和地电极分别置于角膜表面、舌下和尾部。

1.3.3静脉血甲醇浓度的检测erg检查结束后，从右心房抽取静脉血2ml注入枸橼酸钠抗凝管中充分振荡，采用顶空气相色谱法检测血中甲醇浓度。

1.3.4视网膜组织学检查断颈法处死大鼠，迅速摘除双眼球，解剖显微镜下分离视网膜，固定于4％多聚甲醛中48h，按常规制成石蜡切片，he染色，光镜下观察。

1.3.5视网膜超微结构检查按上述方法分离出1mm×5mm大小视网膜组织，pbs漂洗，固定于2.5％戊二醛4℃冰箱过夜，次日1％四氧化锇后固定2h，丙酮系列脱水，epon812定向包埋制成超薄切片，醋酸双氧铀γ柠檬酸铅双染色，透射电镜下观察。

1.4统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，采用sas8.0统计软件的one-wayanova及snk-q检验对各组间差异进行分析，以α＝0.05作为检验水准。

2.1中毒表现

a组大鼠毛色差，活动减少，消瘦；b组1只大鼠于第2次灌胃后5h死亡，其余动物毛色灰暗，反应呆滞，明显消瘦，运动失调，结膜及鼻孔出血。裂隙灯下各组动物角膜、前房、虹膜、晶状体未见特殊改变；直接眼底镜下a组动物出现视网膜血管轻度迂曲及点状出血，b组动物视盘边界不清，表面充血，视网膜灰白混浊，有点、片状出血，血管迂曲变细。c、d组动物毛色光滑，反应如常，眼底无异常改变。实验结束时，c、d组体质量无显著性差异；与对照组比较，a、b组体质量下降，差异有统计学意义（f=30.84，p<0.0001，表1）。

2.2视网膜电图

a组、b组中分别有1只和2只大鼠erg波形熄灭，其余数据见表2。a、b组大鼠的a波及b波振幅较对照组明显下降（p<0.0001）,b组b波潜伏期较其它组别延长（p<0.05），a波潜伏期无明显改变（p>0.05）。c、d组erg各成分之间差异无统计学意义（p>0.05）。erg波形改变见图1。

2.3静脉血甲醇浓度

标准曲线c＝6.8989＋0.008254a（a为峰面积）。相关系数r＝0.9938。a组静脉血甲醇浓度为（43.8±16.5）mmol/l，b组为（219.0±41.0）mmol/l，均显著高于c组（3.4±2.4）mmol/l和d组（14.4±6.2）mmol/l（f=161.42,p<0.0001）；其中b组比a组增高更为明显（p<0.05）。c、d组比较，p>0.05。

2.4视网膜病理改变

2.4.1光镜改变a组视网膜内、外颗粒层排列紊乱，细胞间隙扩大，神经节细胞层轻度水肿（图2a）；b组视网膜各层水肿，光感受器外节出现空泡，外颗粒层、内颗粒层排列明显紊乱，细胞间隙扩大，神经节细胞层疏松、水肿，空泡明显（图2b）；c组、d组视网膜形态正常，结构清楚，各层细胞排列整齐、紧密（图2c、d）。

2.4.2电镜改变b组内、外颗粒层细胞凋亡普遍，细胞核固缩，细胞器结构不清（图3a）；光感受器膜盘排列紊乱、肿胀并出现空泡（图3b）；内、外节及内、外丛状层线粒体广泛肿胀，部分线粒体嵴断裂、空泡化甚至嵴消失（图3c）。a组改变较b组轻，有细胞凋亡现象但不常见。c、d组大鼠视网膜超微结构正常，细胞排列紧密，染色质疏松、清晰，膜盘排列整齐，线粒体形态正常（图3d、e、f）。

3.1急性甲醇中毒的临床诊断标准及模型评价指标

人类急性甲醇中毒主要表现为神经系统和眼部的损害，临床诊断标准依据甲醇摄入史、血液甲醇浓度超标、神经系统及眼部损害的症状和体征如头痛、意识障碍、视物模糊、视野损害、视网膜电图和视觉诱发电位异常等[1,3]。本研究采用灌胃的方式模拟甲醇经口染毒的过程，并借鉴了人类急性甲醇中毒的诊断标准制订模型的评价指标，包括一般表现、静脉血甲醇浓度、erg及视网膜病理改变，从功能学和形态学两方面评价甲醇中毒对眼部的影响，结果显示上述指标与人类中毒后的改变非常接近，表明吸入n2o/o2混合气及甲醇灌胃可复制出典型的急性甲醇中毒大鼠模型。