荧光定量PCR快速检测小儿巨细胞病毒感染

摘要　　目的：探讨小儿HCMV感染性疾病的病原学分布状况及其快速诊断方法。　　方法：荧光探针定量PCR检测患儿血、尿、CFS和母亲乳汁中HCMV－DNA，并与ELISA法检测HCMV－IgM特异性抗体作比较。　　结果：730例患儿血、尿、CSF标本中，FQ－PCR检测HCMV－DNA阳性者271例，总阳性率为37.1％，其中血、尿、CSF的阳性率分别为20.5％、42.9％、22.2％，12例母亲乳汁检出HCMV－DNA阳性者为7例，阳性率为58.3％。按疾病分类HCMV－DNA阳性检出率分别为：婴儿肝炎综合征57.1％，新生儿高胆红素血症40.1％，新生儿败血症41.9％，小儿肺炎21.0％，脑疾患22.2％，紫癜42.4％，以婴儿肝炎综合征检出率最高。129例患儿同时作FQ－PCR与ELISA法比较，阳性符合率为57.1％，阴性符合率为80.3％，由于患儿的病程不同，而出现不同的检出率及其部分结果的不一致性。　　结论：HCMV感染是引起婴儿肝炎综合征、新生儿高胆红素血症、新生儿败血症、小儿肺炎、病毒性脑炎和血小板减少性紫癜等儿科疾病的重要病因，母乳喂养亦是母婴传播的重要途经。同时应用FQ－PCR和ELISA两种方法检测HCMV，可提高阳性检出率。　　关键词：人巨细胞病毒荧光探针定量聚合酶链反应小儿疾病　　本文作者：李连青　曾发表于<中华检验医学杂志2004年2月第27卷第2期>RapiddetectionofhumancytomegalovirusDNAforinfantilediseasesbyfluorescentreal－timequantitativepolymerasechainreaction李连青朱庆义周向红贺润花崔大治刘慧萍LILianqing，ZHUQingyi，ZHOUXianghong，etal.Lab.Abstract　　Objective：TovalueHCMVinfectionstateininfantilediseaseandrapiddetectionmethods.　　Method：DetectingHCMV－DNAandHCMV－IgMspecificantibodyinblood，urea，CSFandmaternalmilksamplesforinfantileHCMVinfectiondiseaseswasusedbyFQ－PCRandELISAassays.　　Results：ResultsofdetectingquantitativeHCMV－DNAinblood，urea，CSFsamplesfrom730patientswithinfantileinfectiondiseaseswasusedbyFQ－PCRshownthat271cases（37.1％）ofinfantilediseasewasHCMV－DNApositive，Amongpositiverateofblood，urea，CSFWAS20.5％，42.9％，22.2％，respectively.While12samplesofmaternalmilkwas7（58.8％）HCMV－DMApositive.PositiverateofHCMV－DNAfor730infantilevariousdiseaseswithinfantilehepatitissyndrome，neonatalhyperbilirubinemia，neonatalsepticemia，braindisease，andpurpurawas57.1％，40.1％，41.9％，21.0％，22.2％and42.2％，respectively.ComparisonFQ－PCRwithELISAassaysresultsshownthat129cilinicalsamplesofinfantilevariousdiseaseswere66（51.2％）samplesHCMV－DNApositivebyFQ－PCR，whereas49（38.0％）sampleswereHCMV－IgMpositivebyELISA.Bothassayscomparison，positivecoincidenceratewas57.1％，whereasnegativecoincidenceratewas80.3％.becausevarycourseofdiseaseshownnodifferenceresults.　　Conclusion：InfantileHCMVinfectionwascauseofimportantpathogeninpediatricdiseases，suchasinfantilehepatitissyndrome，neonatalhyperbilirubinemia，neonatalsepticemia，infantilepneumonia，viralencephalitisandthrombopenicpurpuraetc.Maternalmilkalsoisimportantcausetomaternal－infantiletransfer.FQ－PCRassayisrapid，imple，sensitiveandspecificmethod，andbothFQ－PCRandELISAassayssometimeusedcanincreasedpositivediagnosisrate.　　Keywords：Humancytomegalovirusfluorescentreal－timequantitativepolymerasechainreactioninfantiledisease．　　人巨细胞病毒（HCMV）感染分原发性感染、潜伏性感染和激活性感染。小儿HCMV感染多为原发性感染，尤其是新生儿HCMV感染主要通过母体在宫内感染引起母婴垂直传播，或分娩时通过产道或哺乳期通过乳汁传播婴儿。HCMV一旦感染终生相伴，通常是无症状的，病毒潜伏在宿主细胞中，多种诱因可使潜伏的病毒被激活，而引发明显的临床症状。小儿先天性或获得性感染HCMV可引起婴儿肝炎综合症、生长发育受阻、或中枢神经系统障碍、神经性耳聋等并发症，其后果非常严重。HCMV感染的诊断通常有检测血清中HCMV－IgG、IgM特异性抗体，白细胞中HCMV特异性抗原（pp65），以及分子生物学方法核酸杂交和PCR技术等[1－3]。本文应用荧光探针实时定量PCR（FQ－PCR）检测患儿血液、尿液、脑脊液（CSF）和母亲乳汁中HCMV－DNA，并与血中HCMV－IgM特异性抗体检测作比较，报告如下。材料和方法　　一、临床资料：自1999年9月至2001年12月，在山西省儿童医院门诊和住院患儿共742例，其中婴儿肝炎综合症133例、新生儿高胆红素血症182例、新生儿败血症131例、小儿肺炎233例、脑疾患18例、紫癜33例，患儿母亲12例。年龄分组：《1月新生儿321例、1月～3岁婴幼儿264例、3～7岁小儿83例、7～14岁儿童62例，25～35岁成人（母亲）12例。共收集血液标本171份、尿液541份、CSF18份、母亲乳汁12份。　　二、方　法：　　1．标本收集：血液抽取患儿外周血2ml，EDTA抗凝；尿液留取中段晨尿约10ml；脑脊液抽取2ml于灭菌小瓶中，密封送检。　　2．DNA模板提取：血液用淋巴细胞分离液，分离沉淀白细胞；尿液和脑脊液取1ml，高速离心沉淀后去上清。分别于沉淀物中加50μlDNA裂解液，煮沸10min，离心沉淀，取上清液2μl供作PCR。　　3．PCR程序：于PCR反应管中（由中山医科大学达安基因诊断中心提供），加2μlDNA模板提取液，总容量为50μl。用已知HCMV－DNA含量的标准阳性对照品，制备标准曲线，同时设置阳性和阴性对照，于FQ－PCR扩增仪中（PEGeneAmp－5700型），93℃预变性2min，进入循环，93℃45Sà55℃120S，共40个周期，由电脑自动计算和读取结果。　　4．ELISA法检测HCMV－IgM特异性抗体：129例患儿同时作FQ－PCR和血清HCMV－IgM特异性抗体测定（试剂由深圳科润达生物工程公司提供意大利索利公司进口分装试剂盒），操作按试剂盒说明，用酶标仪（PR－521型）读取和记录结果。　　三、结　果　　各类临床标本HCMV－DNA检测结果：730例患儿血、尿、脑脊液标本，FQ－PCR检测HCMV－DNA阳性者271例，总阳性率为37.1％，其中血、尿、CSF阳性率分别为20.5％、42.9％、22.2％，12例母亲乳汁检出HCMV－DNA阳性者为7例，阳性率为58.3％，见表1。　　小儿各类疾病FQ－PCR检测结果：730例患儿按疾病分类采集各种临床标本，检测HCMV－DNA，阳性者271例，总阳性率为37.1％，结果见表2。　　注：IHS：infantilehepatitissyndromeNHB：neonatalhyperbilirubinemiaFQ－PCR与ELISA检测HCMV结　　近年来的研究发现HCMV是免疫受损病人的重要病原体：如爱滋病（ADIS）、骨髓和器官移植受者等。该病毒亦是宫内感染和威胁生命的巨细胞包涵体病的最常见的原因。由于HCMV原发性感染，可导致生命过程中长期潜伏性感染，因此病毒可长期分泌，而存在血液、唾液、尿液或母亲的乳汁中，临床上可采取这些标本检测HCMV，作为HCMV感染的重要诊断指标[2]。小儿HCMV感染，尤其是新生儿原发性感染，主要是通过母体宫内感染和分娩时通过产道