Graves病伴血细胞减少症患者外周血淋巴细胞的研究/血液学检验文

作者：张海燕　李玉芳

【摘要】　　为了研究Graves病伴血细胞减少症患者外周血淋巴细胞的变化，探讨Graves病伴血细胞减少症的发病机制，以流式细胞术测定24例患者外周血Th细胞亚群及CD5+B淋巴细胞的数量、B淋巴细胞胞浆内凋亡蛋白Bcl?2的表达水平，并与18名正常人作对照。结果表明：正常对照组Th1细胞和Th2细胞百分率、Th2/Th1比值、CD5+B细胞百分率、Bcl?2表达率分别是（0.39±0.24）%、（0.28±0.15）%、（0.52±0.12）%、（7.89±0.38）%、（36.49±6.79）%；患者组Th1细胞和Th2细胞百分率、Th2/Th1比值、CD5+B细胞百分率、Bcl?2表达率分别是（0.81±0.45）%、（6.83±3.02）%、（20.55±6.15）%、（20.89±1.62）%、（80.25±15.56）%，均显著多于正常人对照（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05）。结论：Graves病伴血细胞减少症发病可能与Th1/Th2比例失衡，Th2细胞增多，导致CD5+B细胞数量上升及凋亡减低，自身抗体的产生增加有关。clin-lab.com

【关键词】Graves病;血细胞减少;淋巴细胞;免疫;细胞凋亡临床实验室

　　LymphocyteChangesinPatientswithGraves'sDiseaseAccompaniedbyHematocytopeniaclin-lab.com

AbstractTheaimofstudywastoinvestigatethelymphocytechangesinperipheralbloodofpatientswithGraves'sdiseaseaccompaniedbyhematocytopeniaandtoexploreitspathogenesis.ThequantityandratioofTh2、Th1、CD5+B、Bcl?2levelin24Graves'sdiseasepatientswithhematocytopeniaweredetectedbyFACS,and18adultswereselectedasnormalcontrols.TheresultsindicaledthatthepercentagesofTh1,Th2,ratioofTh2/Th1,CD5+B,Bcl?2leveinperipheralbloodofthepatientswere（0.81±0.45）%,（6.83±3.02）%,（20.55±6.15）%,（20.89±1.62）%,（80.25±15.56）%,respectively,andwerehigherthanthoseofnormalcontrols［（0.39±0.24）%（P<0.05）,（0.28±0.15）%（P<0.01）,（0.52±0.12）%（P<0.01）,（7.89±0.38）%（P<0.05）,（36.49±6.79）%（P<0.05）］.ItisconcludedthatthepathogenesisofGraves'sdiseasewithhematocytopeniamayberelatedtounbalanceofTh1/Th2,increaseofTh2inducingover?expressionofCD5+BandBcl?2onBcell.clin-lab.com

KeywordsGraves'sdisease;hematocytopenia;lymphocyte;immune;apoptosisclin-lab.com

Graves病由Parry于1825年首次报告，是甲状腺功能亢进症的最常见病因，主要表现为甲状腺毒症、弥漫性甲状腺肿、眼征和胫前黏液水肿。目前公认Graves病的发生与自身免疫有关，属于自身特异性自身免疫病，即抗体介导的免疫反应性疾病，临床上经常与血细胞减少症并存，说明两者之间可能存在同样的发病机制，或就是一种疾病的不同阶段的不同组织受累的表现。为探讨其发病机制，我们检测24例Graves病伴血细胞减少症患者的外周血淋巴细胞的变化，并与18名正常人进行了对照，兹报告如下。临床实验室

材料和方法clin-lab.com

病例临床实验室

24例Graves病患者，均为2004年8月至2005年12月在我院门诊及住院的患者，男5例，女19例，年龄16-56岁，平均年龄38.5岁。24例患者均同时符合以下标准：①高代谢症状和体征；②弥漫性甲状腺肿大伴或不伴血管杂音；③血清FT4增高，TSH减低。初诊时血常规检测中仅伴血小板减少者10例，其Plt值（10-78）×109/L；血小板及白细胞均减少9例，其Plt值（30-60）×109/L，WBC值（1.23-3.78）×109/L；全血细胞减少5例，WBC值（2.3-2.58）×109/L，Hb值（70-85）g/L,Plt值（57-70）×109/L。18名正常对照者中，男5例，女13例，年龄18-58岁，平均年龄40.1岁。clin-lab.com

试剂clin-lab.com

所用鼠抗人CD4、IFN?γ、IL?4、CD5、Bcl?2单克隆抗体和鼠抗人CD19单抗克隆抗体均购自美国Ancell生物制剂公司，牛血清白蛋白和RPMI1640购自深圳晶美公司，聚甲基丙烯酸、依若霉素、莫能霉素及皂素购于美国Sigma公司。流式细胞仪为BeckmanCoulter公司产品。clin-lab.com

外周血单个核细胞分离clin-lab.com

采集患者及正常对照者的外周血4ml,以5íTA抗凝，800r/min离心10分钟，去上清，加入细胞培养液RPMI1640至4ml，混匀，用PBS等量稀释后分装于2个离心管中，用Ficoll淋巴细胞分离液（密度1.077）分离单个核细胞。clin-lab.com

细胞培养及细胞因子分泌抑制临床实验室

细胞按5×105/ml的浓度培养，并加入PMA和依若霉素以扩大原有细胞因子的产量，用莫能霉素抑制高尔基体对细胞因子的转运。基本培养基为IMDM，体系如下：10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50ng/mlPMA、250ng/ml依若霉素、140ng/ml莫能霉素。细胞与培养液混合后加入到24孔板中，在37℃、95%湿度、5%CO2培养箱内培养5小时。临床实验室

荧光染色clin-lab.com

用结合异硫氢酸荧光素（FITC）的鼠抗人CD4单克隆抗体直接标记细胞膜CD4，用结合藻红蛋白荧光素的鼠抗人IFN?γ、IL?4单克隆抗体直接标记细胞浆内的IFN?γ、IL?4，Th1细胞为CD4+、IFN?γ+，Th2细胞为CD4+、IL?4+。clin-lab.com

CD19+CD5+细胞测定临床实验室

试管中加入鼠抗人CD19?FITC和鼠抗人CD5?PE各20μl,再加入单个核细胞悬液100μl，混匀，4℃避光孵育40分钟，PBS液洗2遍，加入10g/L的多聚甲醛固定液200μl，混匀，4℃固定30分钟。对照管中加入鼠抗人CD19?FITC和鼠抗人IgG1?PE各20μl，按上述方法操作。最后用流式细胞术测定CD19+CD5+细胞，计算CD19+CD5+/CD19+的表达率。临床实验室

B淋巴细胞胞浆内Bcl?2表达测定临床实验室

加入鼠抗人CD19?FITC20μl,单个核细胞悬液100μl，4℃避光孵育30分钟，用PBS液洗2遍，加入1%的多聚甲醛固定液1ml，混匀，在4℃条件固定15分钟，各加入含1g/L皂素的PBS1ml，室温孵育60分钟，用PBS液洗2遍。在试验管中加入鼠抗人Bcl?2?PE单克隆抗体各20μl。对照管中加入同型不相关鼠抗人IgG1?PE单克隆抗体各20μl，4℃避光孵育40分钟，用PBS液洗3遍，然后加入1%的多聚甲醛固定液200μl，混匀，4℃固定30分钟。流式细胞术测定CD19+细胞胞浆内Bcl?2表达率。用流式细胞仪（FACSVantageBectonDickinson公司产品）进行细胞测定，用cellQuest3.1获取和分析细胞。clin-lab.com

统计学分析clin-lab.com

使用SPSS10.0软件分析，结果以均值±标准差（±SD）表示，计量资料的比较用t检验。临床实验室

结果临床实验室

CD4+IFN?γ+、CD4+IL?4+细胞的检测临床实验室

患者组CD4+IFN?γ+和CD4+、IL?4+细胞百分率增加（0.812±0.45），显著和高于正常对照组（0.39±0.24），（P<0.05）,且CD4+IL?4+升高更为显著（P<0.01）；患者组CD4+IL?4+/CD4+IFN?γ+比值为20.55±6.15，而正常对照组0.52±0.12（P<0.01），提示CD4+IFN?γ+/CD4+IL?4+比例失衡，尽管CD4+IFN?γ+细胞相应增加，仍未能使之平衡（图1、附表）。临床实验室

患者组外周血CD5+CD19+细胞占CD19+细胞的比例为（20.89±1.62）%，正常对照组为（7.89±0.38）%，患者组明显高于正常对照，差异有显著性（P<0.05）。患者组CD5+CD19+细胞中位荧光强度（20.6±2.74）%,明显高于正常对照（9.78±1.55）%,差异有显著性（P<0.05）。患者组CD19+Bcl?2+细胞胞占CD19+细胞的（80.25±15.56）%，正常对照组（36.49±6.79）%，患者明显高于后者，差异有显著性（P<0.05）。Bcl?2+CD19+细胞中位荧光强度（79.8%±11.23）,明显高于正常对照（35.2±4.47）%,差异有显著性（P<0.05）（附表、图2）。clin-lab.com

讨论临床实验室

研究表明，Th对体液免疫及细胞免疫均有调节作用，根据产生细胞因子的不同分为Th1细胞和Th2细胞［1］。Th1细胞主要分泌IFN?γ、IL?2等；Th2细胞主要分泌IL?4、IL?10、IL?5、IL?13等。Th1细胞因子主要参与造血负调控，Th2细胞因子尤其IL?4、IL?10可促进B淋巴细胞生长、增殖和分化为浆细胞，从而产生大量的IgM、IgG和IgA抗体。Villasenor等［2］发现，IL?10还可通过促进抗凋亡蛋白Bcl?2的表达，延长B淋巴细胞的生存时间而促进抗体的分泌。近年来提出的免疫相关性血细胞减少症发病［3,4］主要与Th1/Th2失衡、向Th2细胞偏移、在Th2细胞因子作用下B细胞数量和功能异常有关，并进而产生抗骨髓未成熟造血细胞自身抗体破坏和抑制造血细胞，导致血细胞减少。clin-lab.com

近年的研究发现，Graves病免疫反应是通过抗原单独与B细胞结合启动B细胞抗体而产生，Ts细胞调节失控，可导致针对甲状腺抗原的B细胞和自身抗体增高［5］。对Graves病患者外周血T淋巴细胞的研究时发现，CD8+细胞比例下降，CD4+/CD8+比值升高，且白细胞介素能刺激抗原激活的B细胞活性及凋亡减弱。临床实验室