深低温反复冻融杀伤人眼脉络膜黑色素瘤OCM

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1.4克隆（集落）形成实验

分别取对照组，冻融1、2、3、5次组的细胞，用台盼蓝染色方法记数500个活力好的细胞接种于100mm培养皿中，并使细胞分散均匀,每组均用3个培养皿，置37℃、5%CO2培养箱静止培养14d后，甲醇固定，苏木素染色。记数细胞数>50为一个克隆，计算克隆形成率。

1.5免疫细胞化学染色

细胞经冻融处理后，收集细胞，PBS洗涤，吹散，用微量加样枪滴片，风干，甲醇固定。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10min，加血清并水浴10min，加入一抗P16后，依次加入二抗，S-P/HRP复合物，上述步骤均以PBS缓冲液稍洗3次，DAB显色，Maye′s苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、封片。显微镜下观察。

1.6透射电镜观察

细胞冻融处理后,收集细胞（细胞数量≥1×107个/mL）。加入PBS,1000r/min离心10min（r=12cm）,弃上清。放入预冷的2%多聚甲醛2戊二醛前固定液（pH值为7.3）中,4℃固定2h,再次离心后弃上清。制作电镜切片，在透射电镜下观察及拍照。

1.7激光共聚焦显微镜观察

细胞经冻融处理后，收集细胞，PBS洗涤，吹散，用微量加样枪滴片，风干，甲醇固定。水洗3min，用Hoechst33342染色5min，晾干，甘油封片。共聚焦显微镜下观察。

1.8流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变

细胞冻融处理后,收集细胞（细胞数量≥1×106）。洗涤2次,加入荧光染料Rhodamine123至终浓度5μmol/L,于37℃、5%CO2培养箱中负载细胞30min后，再次洗涤2次,在流式细胞仪下,待荧光强度稳定后，每隔30s计数10000个细胞，连续5次。荧光强度高低代表细胞线粒体膜电位大小。

1.9流式细胞仪测定CD40比率

细胞按上述方法冷冻后，收集细胞（细胞数量≥1×106），每管加入100μL含15%多聚甲醛的PBS，4℃固定15min,离心,弃固定液。加入含10%FCS的PBS4℃封闭2h，洗涤3次后,每管加入5?滋g/mL的CD40单抗各100?滋L,4℃孵育1h，再次洗涤3次，于每孔中加入1∶1000稀释的FITC羊抗鼠IgG作为荧光二抗，4℃作用0.5h后取出，充分洗涤3次后，并设空白对照管，使用流式细胞仪检测，并分析数据。

1.10统计学分析方法

实验的数据均使用ｘ±ｓ表示，SPSS12.0软件对数据进行统计学分析。

2.1细胞的杀伤比率

随着冻融次数增多，杀伤比率明显增加（表1）。

2.2克隆形成实验结果

对照组细胞克隆形成较为均匀,克隆率为27.3%±1.5%。冻融后，细胞的贴壁能力及生长能力明显减弱。克隆形成较小，数目较少,并随着冻融次数的增加克隆形成的量进一步下降（表1）。

2.3免疫细胞化学染色结果

对照组细胞P16阳性（图1A），而冷冻后的细胞均呈阴性（图1B），冷冻后培养的细胞部分呈阳性（图1C）。

2.4电镜观察结果

对照组结构完整，细胞为不规则圆形或多角形，胞浆丰富，胞质均匀，胞质内有丰富的线粒体、粗面内质网、核糖体、高尔基器、溶酶体和微丝;核膜清晰,核大，核仁明显，能见到核分裂。冻融后的细胞内发现梭形，边界清晰，低密度的裂隙，为早期冰晶的超微结构（图2A）。镜下见大量不同时期的凋亡细胞及典型的凋亡小体（图2B）。坏死的细胞密度降低，细胞膜破裂，消失，细胞成分外溢，染色质、胞质均溶解；有的细胞仅余核仁和完整的核膜，其他细胞成分均消失。

2.5共聚焦显微镜观察细胞形态变化

对照组细胞Hoechst33342染色见细胞核蓝色，规则圆形，大小均一（图3A）。冻融处理的细胞，镜下可见凋亡细胞的细胞核固缩而被Hoechst33342染成亮蓝白色。不同冻融次数出现的凋亡细胞比率差异明显（表1）。0.5×3组出现凋亡细胞为最多（图3B）。坏死的细胞，细胞膜消失，细胞内容物逸出，核内容物脱出呈带尾的丝状或礼花状（图3C）。凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多，达到一定程度后随着坏死细胞的增加反而减少。

2.6流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变

冻融作用后,OCM-1细胞线粒体的膜电位下降,增加冻融次数,下降程度更加明显（表1）。

2.7流式细胞仪测定细胞CD40的阳性比率

对照组的OCM-1细胞也有2.6%±0.3%的细胞表达CD40,随冻融次数增加，CD40表达率上升（表1）。