尿液诊断膀胱癌的研究进展

　1.简介膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，在我国每年有约15万的膀胱癌新发病例，而且发病率呈逐年增高之势。由于全部尿路从肾盏、肾盂、输尿管、膀胱及前列腺和尿道均为移行上皮所覆盖，所以90%以上是移行细胞癌（TransitionalCellCarcinoma,TCC），少数为鳞癌和腺癌。移行细胞癌患者中近30％初诊时已有肌层浸润，其余70％为浅表性膀胱癌；虽采用经尿道切除和膀胱腔内辅助治疗可获得良好效果，但复发率高达50％～70％，而且10％～15％的复发肿瘤侵及肌层，有时复发会在术后数年发生。因此，早期诊断和长期复查监测非常必要[1]。

膀胱癌诊断和筛查的主要手段是膀胱镜下活检和尿细胞学检查。虽然膀胱镜是诊断复发性尿路上皮癌的金标准，但是具有侵入性，且对于微小病变和原位癌不易辨认。尿脱落细胞病理学检查虽然无创伤，然而阳性率仅为8%～46%，尤其在检测低级别肿瘤时敏感度更低,而且结果判断具有主观性，容易产生偏差。另外，感染、结石等亦可影响细胞的形态而造成假阳性[2]。鉴于尿细胞学和膀胱镜检查存在的种种缺陷，尿液诊断膀胱癌一直是研究热点并取得了一定的成果。

2.获FDA批准的膀胱癌尿液检测方法

获FDA（美国食品和药品管理局）批准的膀胱癌尿液检测方法迄今只有尿核基质蛋白22、膀胱肿瘤抗原（BTA）、免疫细胞检查法（ImmunoCyt）、纤维素和纤维蛋白原降解产物及荧光原位杂交（FISH）5项。上述方法除FISH以外均已应用多年，但和FISH一样都存在敏感度和特异度不足的问题，只能作为细胞学和膀胱镜检查的补充，无法替代[3]。

2.1核基质蛋白22（NMP22）

NMP22是组成细胞核内部结构的支架,而且同DNA复制、RNA合成、激素联接、基因表达调控密切相关。作为一种核有丝分裂器蛋白，NMP22在分裂间期含量很少。膀胱癌时大量肿瘤细胞凋亡并将NMP22释放入尿，使其水平可增高25倍。以10kU/mL为临界时，它对膀胱癌诊断的敏感度为69.7%，特异度为78.5%，对浸润性膀胱癌诊断的敏感度为100%[4]。但膀胱癌患者尿中NMP22水平增高，与肿瘤的分级、分期不相关。尽管NMP22的敏感度较细胞学检查高很多，但研究证实在有膀胱炎症和其他肿瘤如肾细胞癌存在时，NMP22水平也升高，因此对于已经确诊为膀胱癌的病人来说，NMP22显得更精确一些。

2.2膀胱肿瘤抗原（BTA）

BTA是膀胱肿瘤在浸润和生长过程中释放的蛋白水解酶降解基底膜的各种成分形成的胶原片段、糖蛋白、蛋白多糖等释放进入膀胱腔内形成的复合物。单抗免疫分析法BTA-stat检测敏感度67%～87%,对于膀胱移行细胞癌（BTCC）术后随访肿瘤的特异度49%～70%[4],可用于BTCC的筛查。由于敏感度特异度偏低，近年已逐渐被其他方法所取代。

2.3免疫细胞学检测

免疫细胞学检测是细胞学和免疫荧光的结合，即用单克隆荧光抗体检测膀胱癌脱落细胞的特异性分子标志物。总体敏感度和特异度一般，约为86％和79.4%[2]，而且需要专门的实验室和培训技术人员，应用面不广。

2.4纤维素/纤维蛋白原降解产物

纤维素/纤维蛋白原降解产物是由纤溶酶作用于纤维素和纤维蛋白原后所产生的蛋白质片段。膀胱肿瘤细胞产生的血管内皮生长因子能够增加微小血管的通透性，从而引起血浆蛋白漏出。凝血因子快速将纤维蛋白原转化为纤维素，然后再被纤溶酶进一步降解成纤维素降解产物（FDP）。目前常用的ColorimetricFDP实验简单快速诊断膀胱癌总的敏感度82.1%，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级TCC的敏感度分别为63.2%、88.2%和95%。对于健康者,其他尿路疾患和膀胱镜检未见异常的TCC复查者,其特异度别为96%、86%和80%[5]。但在前列腺癌、膀胱炎症，尤其是肾盂肾炎的病人，FDP实验很容易出现假阳性。

2.5荧光原位杂交

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）是用荧光标记的核酸探针和中期或间期细胞DNA杂交，检测DNA序列及其变化的方法。具有快速、无创性、敏感度高和特异度强等优点。

膀胱癌细胞易发生非随机的染色体改变，包括结构畸变和染色体数目异常。常见结构畸变染色体有3、9、1、5、11、21、17，染色体数目异常有3、9、7、10、11、Y、1、8、17、15[6]。临床研究发现9号染色体部分或全部丢失在膀胱肿瘤中最常见，超过50%膀胱癌患者有此染色体改变，被认为是肿瘤发生的早期事件和关键步骤；其次是17号染色体畸变，可能与肿瘤浸润行为有关，因为有17号染色体非整倍体的肿瘤具有更高复发率和浸润性；7号染色体畸形也常见于膀胱癌，以三倍体多见，也可有四倍体（约占38%），它可以单独出现在膀胱癌，但更多是伴随其他染色体改变一起发生；3号染色体异常在BTCC约占30%，而且常与其他染色体的异常并存，可以有染色体移位和数量变化，与复发有关。其他染色体异常有男性膀胱癌约半数患者被发现Y染色体丢失，11号染色体单体等。

FISH的一个重要特征就是能比膀胱镜更早发现膀胱癌，膀胱镜阴性FISH阳性的术后随访病例在3～12个月中有41％～68％被确诊为膀胱癌，而双阴性的情况下只有19％在3～19个月后确诊为膀胱癌。Vysis公司研发的Urovysion试剂盒通过荧光原位杂交分析尿脱落细胞染色体3、7、17号非整倍体和染色体9p21丢失以诊断膀胱癌，据称能达到85％的敏感度和97％的特异度[7]。

FISH存在的问题有Ta、Tis期肿瘤相对敏感度较低。尿液量不够，低肿瘤负荷，肿瘤细胞未脱落也可能对敏感度有影响。而且高昂的价格和繁琐的操作过程也影响了它的应用和推广。

由于这些诊断方法依然无法满足临床需要，近年来，经过广大科研人员的努力，发现了很多具有诊断潜力的膀胱癌分子标志物。

3.研究中的分子诊断方法

3.1染色体检测

3.1.1短串联重复序列（STR）检测在肿瘤发生机制上，除了癌基因激活以外，抑癌基因失活也起了极大的作用。通常抑癌基因失活多通过杂合性缺失途径（LOH），包括两个独立的过程，一个等位基因所在染色体片段缺失和另一个等位基因发生突变或甲基化，是膀胱癌时p16抑癌基因失活的最常见机制。微卫星不稳定性（MSI）是研究LOH的最常用方法。微卫星是广泛存在于原核及真核细胞基因组中的简单串联重复序列,其数目巨大且分布广泛。人基因组中平均约50kb就有一个位点存在，是基因复制或细胞减数分裂过程中染色体不对等交换产生的寡核苷酸重复序列。大量研究显示,在TCC中存在总体上染色体的不稳定性,多条染色体多个区段发生LOH。研究证明只需做20个高信息含量位点就可以达到充足的信息量[8]（敏感度95％以上）用以检测各种类型膀胱癌，而且不受肿瘤病理分级和分期的影响。另有研究显示微卫星改变存在人种差异或病因学差异，因而选择地域、种族特异性微卫星位点组合,有可能显著提高膀胱肿瘤诊断的敏感度和特异度。有研究表明,在膀胱炎性改变时尿沉渣微卫星分析有很高的假阴性,虽然微卫星在研究LOH方面是值得信赖的，但是由于大量的LOH模式尚未清晰，还需要花费大量的时间和精力去研究，再加上MSI分析需要异常细胞含量占到10％以上，以及尿沉渣细胞无法满足的大量DNA，这些都限制了它的应用。Utting等[9]认为,利用尿液离心后上清液中游离的DNA（无细胞沉淀物）作为检测标本分析微卫星异常诊断膀胱癌优于尿液细胞沉淀物,其原因可能是上清液中肿瘤DNA与正常细胞DNA的比值高于尿沉淀物,更利于检测LOH。

3.1.2单核苷酸多态性检测DNA的单核苷酸多态性（SNP）亦是研究LOH的方法之一。他们大量存在于人类染色体中，大约相隔100－300bp就有一个，因此检测SNP比微卫星技术敏感度更高[10]。现有的检查手段,包括尿液细胞学检查和一些分子标志物检查都受一些问题的困扰,例如难以区分肿瘤细胞和炎性细胞,对于高分化癌诊断的阳性率过低等,尿液脱落细胞SNP的检测有可能克服这些缺点,成为膀胱癌早期诊断的理想指标[11]。但SNP检测的不足也很明显，使用基因芯片的方法成本比较高，另外尚无证据表明能帮助肿瘤的分级和分期。

3.1.3甲基化检测CpG岛是人类基因启动子富含CpG双核苷酸的区域,在正常状态下是未甲基化的,其甲基化状态与基因转录及表达活性有关,并因此影响基因的功能。随着甲基化检测技术的出现和不断改进,发生启动子过甲基化的基因数目在迅速增加。CpG岛的过甲基化几乎在每种类型的肿瘤中都有发生,并且涵盖了DNA修复、细胞周期、细胞凋亡、细胞黏附、细胞代谢等各个方面[12]。

由于膀胱癌发生的机制具有多样性，因此在不同膀胱癌中检出的发生甲基化位点也不尽相同。至今仍无单个基因能达到足够诊断的敏感度和特异度的例子。但很多研究人员使用不同的位点组合检测膀胱癌病理标本已经达到了90％以上的敏感度和特异度[12]，受尿沉渣细胞量的限制，敏感度普遍稍低，虽然亦有100％的报道，但尚缺乏大样本研究证实。

甲基化研究有助于肿瘤分级分期和预后判断。Catto等[13]研究了12个基因启动子的甲基化情况，检出率为86％。其中RARb，DAPK，CDH－1，RASSF1A甲基化情况和肿瘤分期相关，DAPK，RASSF1A启动子甲基化阳性的膀胱癌更容易恶化并且后者和高病死率密切相关。对于原位癌（pTa），DAPK或者hMLH1甲基化预示着更高的复发概率。pT1患者中RARb甲基化的肿瘤不易进展，病死率也低。CDH－1在pT2－4的患者中有一定的保护意义。Friedrich等[14]从抑癌基因、凋亡相关基因、黏附分子、血管生成等4大类21个基因中筛选出6个基因甲基化和膀胱癌复发相关。给甲基化研究又添加了一项优点。

甲基化检测的手段多种多样，现在常用的甲基化特异性PCR还具有如下优点：①高通量，高敏感，最低能检出含量只有0.1%～0.01％的异常DNA，能早期检出微小的肿瘤甚至是癌前病变。②不像突变检测，无需对基因进行测序、排除变异情况等复杂的前期准备。③相比LOH检测能省去血液匹配检测等麻烦的过程[15]。但其缺点也很明显，需要亚硫酸盐处理过夜，步骤较多，费时较长，模板在处理之后变成小片段，影响扩增，泌尿系统其他肿瘤脱落细胞可能会混杂其中影响结果判断。

3.2细胞成分检测

3.2.1生存素（survivin）生存素是凋亡抑制蛋白,在多种人类肿瘤中均可上调。研究发现尿液标本中生存素水平检测总的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值分别为64%、93%、92%和67%[16],这些指标均优于传统的尿液细胞学检查和NMP22检测,且尿液中高水平的生存素与膀胱癌的患病风险增加和高分级有关。更值得注意的是,在表浅性膀胱癌的研究中,生存素表达的高低与表浅性膀胱癌的无瘤生存密切相关,表达明显升高者,预后差,多因素分析结果表明生存素是判断表浅性膀胱癌预后的一个独立指标。如果这些结果在大样本的研究得到确证,尿标本中生存素水平的检测将能够替代细胞学检查,成为膀胱癌诊断和监测的理想指标。

3.2.2端粒酶端粒是位于DNA链3’末端的核苷酸序列，在DNA复制时并不被复制，因此每一循环的复制约损失50～200个核苷酸，最终促使细胞停止分裂。端粒酶将含有6个核苷酸（TTAGGG）的重复序列加到DNA链的3’末端上，从而维持染色体的长度。在正常成人体细胞内不表达,但在多种肿瘤细胞中表达。利用端粒酶诊断膀胱癌的敏感度差异较大，多数研究结果为70%～86%;特异度为24%～90%,但大多为60%～70%[17]。检测敏感度的差异与标本的收集、膀胱癌的分期、分级和检测方法有关。不同方法采集的尿液标本其敏感度不一样。在血尿、前列腺增生、膀胱炎等疾病时检测端粒酶可有假阳性,有报道假阳性率甚至高达76%。由于膀胱癌患者往往合并有其他泌尿系病变,其次尿液的收集、保存与端粒酶活性密切相关,因此,目前这一检测手段在临床上的应用受到了限制。另外，RT－PCR检测的方法正在发展中，显示出了更好的特异性。

3.2.3核基质蛋白（BLCA-4）肿瘤与正常细胞的核基质蛋白组成有所不同，有6种核基质蛋白（BLCA－1～6）只存在于肿瘤组织中，而另有3种核基质蛋白仅存在于正常膀胱组织中。初步的研究显示其诊断BTCC的敏感度96.4%,特异度100%[18],同分级分期无关,BLCA-4的升高同尿路感染、抽烟和膀胱炎关系不大。脊髓损伤的患者尿液中BLCA-4的升高可能预示着膀胱肿瘤的发生。BLCA-4的研究报道尚少,其临床意义尚需进一步的研究，类似标志物还有新近发现的BLAC－1[19]。

3.2.4黏蛋白-7黏蛋白是尿路上皮黏膜的保护屏障，黏蛋白基因MUC7的上调可能导致糖基化类型异常、增加肿瘤浸润和转移潜力。尿液标本中MUC7基因表达检查的敏感度和特异度分别为68%和87%，MUC7基因表达和肿瘤分级、分期和大小之间没有相关性。MUC7基因表达可能成为一种非侵入性的筛选方法[4]。

3.2.5透明质酸和透明质酸酶（HA/HAase）透明质酸酶是一种降解细胞外基质透明质酸的内生性糖甙酶,在肿瘤侵袭过程中发挥了重要作用。在膀胱癌患者尿液中HA的含量升高5～7倍,而HAase仅在高分级肿瘤中有升高（G2/G3肿瘤中升高4～7倍）。HA、HAase诊断膀胱癌的敏感度、特异度在86%～92%[2]。

3.2.6白细胞分化抗原44（CD44）CD44是一种广泛分布于细胞表面的糖蛋白,被认为是一种细胞外黏附分子。据报道肿瘤进程与CD44的表达量及分布密切相关。在尿液脱落癌细胞中,CD44基因也有异常转录。Western杂交试验发现,在75%膀胱癌患者尿液细胞溶解产物中发现几种相对分子量高的CD44（160000）,对照组则无。免疫组织化学研究发现,随着正常膀胱黏膜表皮细胞的分化和成熟,CD44蛋白表达下降,而癌细胞中的CD44蛋白则过量表达并可穿透表皮层进入尿液中。CD44有可能成为膀胱癌的检测指标之一[20]。

3.2.7中心小体异常癌细胞基因不稳定可以由非整倍体所致,非整倍体是一种染色体的异常平衡,可能来自中心小体的功能异常,中心小体是负责进行平衡的染色体聚集的细胞器。M.D.Anderson癌中心的Jiang等[21]采用针对中心小体主要成分γ2微管蛋白的抗体检测了膀胱冲洗液标本中细胞内中心小体的数量和分布,约90%的膀胱癌患者膀胱冲洗液标本中存在中心小体异常,对照组中没有发现,中心小体异常随着肿瘤分级的提高在数量和大小上增加,显示出非整倍体的标本均有中心小体异常。此方法可能是一种比检测DNA非整倍体或多靶点FISH法更简单、更敏感的检测染色体异常的方法。虽然以前的研究提出了几种其他人类恶性肿瘤有中心小体异常，此研究未被其他研究者所证实。但是考虑到甚至在低分级膀胱癌中也有中心小体的显著异常,此标志物可能被用于膀胱癌的早期检测，成为肿瘤进展的标志物。

此外，一些新的膀胱癌或分子标志物如p53,H-ras,DBC突变，MDM2、Fas-Fas配体系统、Bax、COX2、E2F3、TIMP、DNMT1表达等都显示出了良好的理论价值，但还需要大量实验数据的支持。

在最近刚召开的第100届美国泌尿外科学会（AUA）年会上，依然只有尿脱落细胞学检查及尿NMP22检测是推荐的筛查手段，研究膀胱癌标志物依然任重而道远。但合理联合应用现有的无创伤检查手段,可推迟或减少膀胱镜检查。随着基因芯片技术的发展,对膀胱癌的认识不断深入,膀胱癌分子标志谱更完善,相信在不远的将来,通过尿液诊断和监测膀胱癌必将有新的突破。

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