尼莫地平对脑挫裂伤后神经细胞内游离钙浓度的影响

【摘要】目的研究尼莫地平对脑挫裂伤后神经细胞胞浆内游离钙离子浓度变化的影响。方法将Wistar大鼠随机分为对照组、创伤组、治疗组；创伤组按照Feeney自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型，治疗组在外伤后开始静脉滴注尼莫地平。分别对脑挫裂伤后0.5、1、3、6、12、24、48?h各时相点细胞内游离钙离子浓度和细胞凋亡率进行检测。对不同时相的创伤组、治疗组和对照组进行比较分析。结果脑挫裂伤后大脑皮层神经细胞内游离钙离子浓度迅速升高，0.5?h时为正常值的4倍，24?h时达到高峰，48?h时降低明显，但仍然维持在比较高的水平。应用尼莫地平治疗后，钙离子浓度显著降低，6?h时降至接近正常水平。脑挫裂伤后神经细胞凋亡率和胞内游离钙离子浓度存在相关性。结论脑挫裂伤后神经细胞胞浆内钙离子浓度升高，导致钙超载并引起细胞凋亡。早期应用尼莫地平能抑制钙超载，抑制细胞凋亡，对神经细胞具有极强的保护作用。

【关键词】细胞凋亡钙脑损伤尼莫地平

apoptosisinratneuralcellsfollowingcerebralcontusions

ZHENGZhiming,WUHongxi,TENGLiangzhu

（DepartmentofNeurosurgery,ProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250021,China）

TostudytheeffectsofnimodipineonintracellularfreeCa2+concentrationinratneurocytesfollowingcerebralcontusions.MethodsWistarratswererandomlydividedintothreegroups:thecontrolgroup,thetraumagroupandthetreatmentgroup.ThecerebralcontusionmodelswereestablishedbasedontheFeeneymethodandnimodipinewasimmediatelyadministeredaftercerebralcontusions.Therelatedparametersatdifferenttimesaftercerebralcontusionweredetected.IntracellularfreeCa2+concentrationandapoptosisrateweredeterminedbyflowcytometry.ResultsAftercerebralcontusion,intracellularfreeCa2+concentrationwasincreasedandreachedapeakat24?handthengraduallydecreased,butitstillmaintainedahighlevelat48?h,whilenimodipinemadetheintracellularfreeCa2+concentrationremarkablydecreaseandtheCa2+levelwasdecreasedtothenormallevelat6h（94.85±15.63?nmol/L）.ConclusionIntracellularfreeCa2+concentrationisrelatedtoapoptosisrate.NimodipinecandecreasetheCa2+levelsandhassomeprotectiveroleagainstcerebralcontusion.

Keywords：Apoptosis;Calcium;Braininjuries；Nimodipine近年来一系列的脑外伤动物模型及人脑组织标本的研究证实，细胞凋亡在颅脑损伤后的病理生理演变中有重要的生物学效应。目前认为，细胞内游离钙升高可引起其凋亡［12］。钙超载影响神经细胞的结构和功能,会促发和加重继发性脑损伤,导致神经细胞出现凋亡甚至死亡。尼莫地平为临床上常用钙通道阻滞剂,已有实验证实对脑缺血缺氧引起的脑损伤具有保护作用［3］。本研究旨在明确脑挫裂伤后神经细胞胞内钙离子浓度是否升高，及升高钙离子和细胞凋亡有无相关性，同时观察尼莫地平对脑挫裂伤后细胞内游离钙离子浓度和细胞凋亡率的影响，为其临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料健康雄性Wistar大鼠，体质量320～350?g，由山东大学实验动物中心提供；胎牛血清、胰蛋白酶购自杭州四季青公司；Fluo3/AM和AnnexinVFITC/PI试剂盒购自美国Sigma公司；尼莫地平由山东新华制药股份有限公司提供；F3010荧光检测仪系日立公司生产。

1.2.1动物分组随机将健康雄性Wistar大鼠102只分为对照组（6只）、创伤组（48只）、治疗组（48只）。对照组只给予颅骨开窗，不致伤；创伤组给予打击制作外伤模型；治疗组外伤后给予尾静脉滴注尼莫地平，首剂5?g/kg,20?min内静脉注入,维持量0.5?g/（kg·min）。其中后两组又分为伤后0.5、1、3、6、8、12、24、48?h8个时相组,每组6只大鼠。

1.2.2脑挫裂伤模型的建立按照Feeney［4］自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型。2％戊巴比妥钠50?mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠，俯卧固定在脑立体定向仪上，75%无水酒精消毒，切开头皮，分离骨膜，前囟后3.0?mm向左旁开矢状缝3.0?mm为中心作直径为5mm的圆形骨窗，保持硬膜完整不受损伤。以40?g砝码于25?cm高处沿套管下落，撞击置于致伤底座（直径3.5?mm，最大下陷距离3.0?mm），造成左顶部局限性脑挫裂伤，致伤力为1?000?g/cm。用骨腊封闭骨窗，缝合头皮，置鼠笼喂养。对照组仅作头皮切口，颅骨开窗，不致脑损伤，于相应时相点处死动物。

1.2.3细胞悬液的制备无菌条件下快速断头取脑，剥离出大脑皮层,显微镜下剥除软脑膜、血管，Dhanks液冲洗2遍，用眼科剪将其剪碎成匀浆状。加入0.125%胰蛋白酶，37?℃CO2培养箱内消化15?min，加入含200?mL/L胎牛血清的DMEM培养液,室温终止消化15?min。用移液管轻轻吹打，将细胞悬浊液用200目铜网过滤。1?000?r/min，离心10?min，弃上清液，收集沉淀，Dhanks液冲洗2遍。台盼蓝染色计算细胞存活率，确认活细胞在90%以上，并对细胞计数。

1.2.4神经细胞内钙离子浓度的测定在制备好的细胞悬液中加入flour3/Am（终浓度5?μmol浓度）37?℃孵育45?min。加入100?μL含20％TritonX100和20?mmol/LCaCl2溶液，测得Fmax，再加200?mmol/LEGTA（pH7.0）100?μL，测得Fmin。日立F3010荧光检测仪检测F、Fmin和Fmax。细胞内Ca2+浓度按下式计算：Ca2+浓度＝Kd×（F-Fmin）/（Fmax-F）。式中Kd是Ca2+结合Fluo3/AM的解离常数，Kd＝316nmol/L，F为测定荧光信号。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡率取6×105个细胞，0.3％胰酶消化。1?000?r/min，4?℃，离心7?min，弃上清液，细胞用PBS冲洗2次，悬浮于200?μLbindingbuffer，加入10?μLAnnexinV/FITC，轻轻混匀，室温、避光孵育15?min，加入5?μLPI液，300?μLbindingbuffer混匀后用流式细胞仪分析，区分活细胞、早、中、晚期凋亡及坏死细胞。

1.3统计学处理全部实验数据均采用SPSS11.0医学统计学软件进行分析，以

2.1脑挫裂伤后神经细胞胞内钙离子浓度和细胞凋亡率的测定脑挫裂伤后大脑皮层神经细胞内Ca2+浓度迅速升高，0.5?h时约为正常对照组的4倍，随着时间的延长，Ca2+浓度逐渐升高，24?h时达到高峰，48?h时降低明显，但仍然维持在较高水平，见图1。不同时相创伤组均较对照组细胞内Ca2+浓度显著性升高（P＜0.01）。细胞凋亡率在脑挫裂伤后0.5～12?h无明显变化，24?h以后显著增加（P＜0.01），见表1。

48?h时对照组与创伤组神经细胞胞内Ca2+浓度变化经拟合后变化趋势的对比

脑外伤后神经细胞会发生一系列的内分泌、核酸代谢变化，导致迟发生神经细胞凋亡。细胞内Ca2+浓度的升高可激活某些蛋白酶、磷脂酶和内源性核酸酶，这些酶的激活可诱发细胞凋亡［5］。已有研究［67］证实，细胞内钙离子浓度的升高的确参与了细胞凋亡的早期决定阶段。McConkey等［8］认为钙离子通过两条途径诱导细胞凋亡:①胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流促使胞浆Ca2+浓度持续升高启动细胞凋亡；②钙离子的释放打破了钙稳态，启动细胞凋亡效应系统和细胞基质接触诱发细胞凋亡。

本研究表明，大鼠脑挫裂伤后Ca2+浓度的变化具有时间依赖性。刘石林等［9］在大鼠脑挫伤后脑不同部位组织内钙含量的变化研究中同样发现脑挫伤后脑细胞内游离钙明显增加，各脑区细胞内钙含量都明显升高。本研究发现细胞凋亡率在脑挫裂伤后0.5～12?h无明显变化，24?h以后出现显著增加。吴思荣等［10］在人脑挫裂伤后神经细胞凋亡的研究中发现颅脑损伤患者伤后4?h即发生神经细胞凋亡，高峰在23～72?h，且神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞均可发生凋亡。本研究同样观察到在大鼠脑挫裂伤24?h后凋亡率显著升高。

尼莫地平作为电压门控钙通道阻滞剂,在蛛网膜下腔出血等疾病中的治疗作用已得到肯定,但对其在脑缺氧缺血损伤中的作用,不同的实验有不同的结论。在挫裂伤组织内谷氨酸、甘氨酸等增加,过度激活N甲基D天门冬氨酸（NmethyDaspartate,NMDA）受体,引起大量钙内流,导致钙超载。而尼莫地平可与NMDA受体结合,阻止过度的钙内流，抑制钙超载,从而阻断其介导的神经毒性作用。本实验应用尼莫地平治疗后，各组钙离子浓度都显著降低，8?h时降至接近正常水平，表明尼莫地平的应用最佳时机在早期。应用尼莫地平后细胞凋亡率0.5～12?h无明显变化，24?h以后凋亡率减少，48?h时减少最明显。说明细胞凋亡具有时间依赖性，随着伤后时间的延长，凋亡率逐渐增加。邹吉敏等［11］应用原位末端标记法观察实验组海马神经细胞凋亡的情况，发现大鼠脑挫裂伤后24?h海马区神经细胞开始出现凋亡阳性细胞,72?h、120?h逐渐增多,168?h达到高峰,240?h开始下降，并且大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞凋亡与时间有关。凋亡时相点的变化规律可为临床及时采取有效的治疗措施提供可靠的理论依据。