本实验旨在研究流式细胞术（flowcytometry,FCM）在
膀胱癌细胞的多药耐药分析方面的作用，现报道如下。
一、材料与方法
1.试剂及仪器：DMEM、DNA提取试剂盒DNAzol、RNA提取试剂盒Trizol为Gibco产品；秋水仙素、甲酰胺、polybrene为Sigma产品；缺口平移系统（nicktranslation）为Promega产品，尼龙膜为ZetaProbe产品；鲑鱼精DNA购自晶美生物公司；MDR-1pCR引物P1：5′CCCATCATTGCAATAGCAGC-3′,P2:5′-CTTCAAACTTCTGCTCC
tGA-3′［1］，由军事医学科学院放射医学研究所合成；抗P-gp单克隆抗体JSB1购自福州迈新公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术公司；阿霉素由法玛西亚公司福建办事处提供；FCM检测由北京中医研究院西苑医院流式细胞室完成。
2.细胞株：转导人mdr-1cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317/PHamdr-1/A由本室保存［1］。人膀胱癌细胞株EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供。以上细胞均生长于DMEM培养基中，其中含体积分数为10%的胎牛血清和200mmol/L的L-谷氨酰胺，在体积分数为5%的CO2、37℃培养箱中培养。逆转录病毒转染EJ细胞参照文献［1］进行。
3.转mdr-1基因细胞系EJ/MDR的鉴定：（1）PCR分析mdr-1基因的整合：参照DNAzoldNA提取说明书提取EJ/MDR-1细胞基因组DNA，取1μlDNA用于PCR扩增。50μl体系：200μmol/LdNTPs、1.5mmol/LMg2+，2种引物各0.5μmol/L，95℃预变性1min，加Taq酶2U（Promega公司）。PCR仪上扩增：94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后72℃延伸7min，2%琼脂糖凝胶电泳检测167bp特异扩增带。（2）外源基因在转染细胞的表达分析：mdr-1基因cDNA探针用StuⅠ酶切质粒PHamdr-1/A获得，DIG缺口平移法标记探针，按Trizol说明书提取细胞总RNA，甲醛变性电泳检测RNA的质量，紫外吸收法定量，按文献［4］进行RNAdotblot。
4.间接免疫荧光分析：收集对数生长期EJ/Mdr-1及EJ细胞，PBS洗涤、离心2次。调节细胞浓度至1.0×105个/ml,加入P-gp单抗JSB115mg/L,4℃放置30min；冷PBS洗2次，加入FITC标记羊抗鼠IgG，FCM检测P-gp蛋白表达；参照文献［3］行抗体稀释及细胞固定，4℃继续放置30min；冷PBS洗2次后送检。
5.FCM测定转基因细胞内阿霉素浓度：参照文献［3］进行。MTT法检测EJ/mdr-1细胞对化疗药物的体外敏感性：参照文献［4］进行。
二、结果
用PA317/PHamdr-1/A病毒上清转染的EJ细胞，秋水仙素（120μg/L）加压筛选3周，获得抗性克隆，命名为EJ/mdr-1，培养传代。提取EJ/mdr-1细胞DNA行PCR检测，可特异性扩增出167bp的mdr-1基因片段，而其亲代EJ细胞则未扩出此片段，从而证实有mdr-1基因的整合。提取已转导mdr-1基因的EJ细胞RNA，Dotblot结果证实EJ/mdr-1细胞中有mdr-1mRNA表达。mdr-1在EJ及EJ/mdr-1的阳性表达率分别为（7.5±2.1）%和（19.6±4.3）%，差异有显著性（P＜0.05）。EJ/mdr-1及EJ细胞内阿霉素荧光强度分别为16.85±4.12和5.59±3.65，差异有显著性（P＜0.05），MTT法检测发现，EJ/mdr-1细胞对阿霉素、秋水仙素的耐药倍数分别是其亲代EJ细胞的7.2倍和9.5倍，差异均有显著性（P＜0.01）。
三、讨论
我们采用逆转录病毒介导将mdr-1基因转入人膀胱癌细胞株EJ，经PCR、Dotblot检测证明mdr-1基因的整合及mRNA水平的表达，FCM结果表明转染细胞的P-gp表达也有提高，并最终导致细胞内药物浓度下降，对阿霉素、秋水仙素等亲脂性化疗药物的敏感性降低，说明膀胱癌的多药耐药性与MDR基因及其产物的P-gp过表达有关。
参考文献
［1］FengK,PeixT,WangLH，etal.Priliminarystudyofretroviralmediatedtransferofthehumanmdr-1geneintomurineandhumanhematopoieticstem/progenitorcells.ChinCancerres,1997,9:268-271.
［2］YangJM,GoldenbergS,GottesmanMM，etal.Characteristicsofp388/VMDRC.04,asimple,sensitivemodelforstudyingP-Glycoproteinantagonists.cancerRes,1994,54:730-737.
［3］郑国强，韩济生，刘叙仪，等.人胃
腺癌阿霉素耐药细胞系BGC-823/DOX耐药机理的研究.中华外科杂志，1997，36：325-328.
［4］SteinU,WaltherW,ShoemakerRH.Reversalofmultidrugbytransductionofcytosinegenesintohumancoloncarcinomacells.JNationalCancerinstitute,1996,88:1383-1391.
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