金黄色葡萄球菌感染

摘　要：采集发病的野生岩羊肝、脾等组织样品，进行病原分离鉴定。分离的细菌为革兰氏阳性成对或成堆排列的球菌。分离菌在普通琼脂上生长良好，放置2d～3d菌落由淡黄色变为黄色，在鲜血琼脂上培养14h见到菌落周围呈β溶血，对小白鼠有致死作用，凝固酶试验为阳性，动物接种试验、PCR扩增和血清学试验未发现病毒感染。据此，确诊为金黄色葡萄球菌感染。

关键词：野生岩羊；病原；分离与鉴定；金黄色葡萄球菌

2005年4月以来新疆塔什库尔干自然保护区内野生岩羊、北山羊发病和死亡较往年同时期增加，病情有蔓延的趋势，对该区域内家畜和当地群众公共卫生健康构成潜在威胁[1]。笔者对该区域内野生动物疫情进行了流行病学调查、临床病理学检查和实验室诊断，现报告如下。

1　流行病学调查

在自然保护区内的马尔洋乡和达布达尔乡热斯卡木村区域内进行了流行病学现况调查。通过询问当地的牧民、兽医和野生动物保护人员，发现发病羊主要为岩羊和北山羊。从2003年起在该地区的岩羊和北山羊每年从4月至12月有不同程度的死亡；死亡率较往年高，主要在海拔3200m以上的区域。发病羊表现为消瘦，精神委靡，同时发现体外寄生虫感染率较高，且不分性别、年龄和种属。另外，当地牧民及兽医提供的信息表明在笔者调查的沟系以外的岩羊和北山羊发病和死亡情况相似。除自然死亡外，动物死亡前的症状和死亡后病变基本相同。流行的范围极广，部分死亡的岩羊和北山羊有不同程度的白内障引起营养不良而死亡。

2　临床诊断

主要症状表现为消瘦，失眠，四肢内侧、下腹部及四肢皮肤形成厚的结痂；严重病例，患部发生丘疹，水疱，脓疱痂垢，相互融合后形成大面积的龟裂、易出血的污秽痂垢。部分病羊在口角、嘴唇边缘和鼻镜上发生小而散在的红斑，形成麻籽大小的结节，继而成为水疱或脓疱，破溃后结成黄色或棕色的疣状硬痂。波及整个口唇周围、颜面及眼睑，有的形成白内障。

3　病理剖检变化

通过剖检4只4岁的濒死期的病岩羊，发现主要眼观病变为肺气肿，肺间质增厚，心肌衰竭，肝脏脂肪变性，胆囊肿大3倍～4倍以上，肾脏肿大，脾脏周围有散在的出血点。在体表胸下、腹下部及四肢内侧形成大面积的皮肤坏疽。

4　实验室诊断

采取2只活体岩羊的血液，分离血清。另外，剖检采集濒死期岩羊实质脏器组织和口角、嘴唇边缘、鼻镜的痂皮，在实验室进行病原分离与鉴定。

4.1　细菌分离与鉴定

4.1.1　病原检查　分别取岩羊的肝、脾组织，做涂片数张，瑞氏和革兰氏染色镜检，可见革兰氏阳性单个、成对或呈堆排列的球菌，但未见两极着色现象。

4.1.2　细菌培养　将上述病料接种于普通琼脂和麦康凯琼脂平板上，37℃培养18h。在普通琼脂平板上可见生长良好、表面光滑、边缘整齐、稍隆起、不透明的圆形细小菌落，放置2d～3d菌落由淡黄色变为黄色。麦康凯平板上未见细菌生长。挑选单个菌落涂片，革兰氏染色镜检，可见革兰氏阳性的球菌。挑取单个菌落分别接种于高盐甘露醇酚红琼脂和鲜血琼脂，置37℃温箱培养。在鲜血琼脂上培养14h可见菌落周围呈β溶血。在高盐甘露醇酚红琼脂上培养2d～3d培养基由红变黄。将单个菌落接种于普通肉汤，37℃孵育24h呈均匀、混浊生长，无菌膜与菌环，继而管底形成少量沉淀，轻轻摇振呈瓣状上升。涂片，革兰氏染色镜检，均为单个、成对或呈葡萄串状革兰氏阳性的球菌。

4.1.3　凝固酶试验　取兔血浆（生理盐水做1∶5稀释）2mL加入0.4mL培养14h的肉汤培养物，置37℃温箱培养，每隔2h观察一次，孵育至8h，兔血浆全部凝固。

4.1.4　致病力试验　取6只小白鼠分成2组，实验组4只，对照组2只。实验组每只皮下注射0.2mL14h的肉汤培养物，对照组注射0.2mL生理盐水，隔离饲喂观察。实验组小鼠24h表现精神委靡，喜卧不食，到第5天死亡2只，第6天死亡1只。剖检死亡鼠，取肝组织涂片，革兰氏染色均为革兰氏阳性的球菌，形态同上所述。直到2周以后，其余1只健活，致死率为75%。对照组小鼠均正常。

4.1.5　生化试验　用岩羊的肝脏分离株和脾脏分离菌做生化试验，结果见表1。

根据上述培养特性和生化试验结果确定分离菌为金黄色葡萄球菌。

5　病毒分离与鉴定

5.1　兔感染实验

根据流行病学和临床症状表现，初诊为疑似羊痘或羊口疮。因此，将采集的濒死期岩羊口角、嘴唇边缘和鼻镜的痂皮等病料按1∶2加入0.1mol/LPBS研磨后再加入双抗（青霉素与链霉素1万单位/mL），置室温作用3h后，划痕涂搽于4只兔嘴唇周围和大腿内侧，观察1周无异常表现。

5.2　PCR扩增

根据GenBank中痘病毒标准株的P32基因序列和副痘病毒的NZ­2基因序列分别设计两对引物，对采集的病料提取DNA，然后进行PCR扩增，再将扩增产物进行凝胶电泳分析，未见目的片段出现。

5.3　口蹄疫病毒血清学试验

对采自保护区的未免疫口蹄疫疫苗的30份羊血清和两份岩羊血清样品，应用羊血清的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒（FMD3ABC­I­ELISA试剂盒，中国农业科学院兰州兽医研究所研制）对其进行检测，其检测结果均为阴性，说明被检测羊体内无非结构蛋白3ABC抗体产生，证明未感染口蹄疫病毒。

6.1　将收集的血清及采集病料做了部分疑似病毒感染的诊断，在实验室进行病毒分离与血清学检测，其结果均为阴性，初步排出疑似的病毒感染。