大鼠角膜碱、酸、热烧伤后房水中TGFβ2的变化研究

【摘要】　目的：通过检测角膜烧伤后前房水中TGFβ2含量的变化，探讨在眼部内环境下TGFβ2与角膜烧伤之间的关系，为角膜烧伤治疗提供依据。方法：制备Wistar大鼠角膜碱、酸、热中度烧伤动物模型，分别于伤后4,8h;1,3,5,7,14,28,49d处死。采集房水：用20g/LBSA包被的毛细管于角膜缘处刺入角膜，吸取房水至20g/LBSA包被的离心管中，70℃保存。标准品和样品进行酸激活处理。使用ELISA方法检测角膜烧伤后前房水中TGFβ2的水平。结果：大鼠角膜碱烧伤后4hTGFβ2的水平呈现一过性升高，然后下降，3d时TGFβ2含量再次升高，7d时达高峰，持续至7wk时降至正常。大鼠角膜酸烧伤后4hTGFβ2的水平呈现一过性升高，然后下降，低于正常对照组，两者差异显著。7d时房水中TGFβ2升至正常，然后一直保持低平状态。49d时我们检测房水中TGFβ2水平仍低于正常。大鼠角膜热烧伤后4hTGFβ2的水平呈现一过性升高，1d时降至最低，3d时开始增长，直到7d时我们检测仍高于正常，然后缓慢下降。结论：角膜烧伤后前房水中TGFβ2的含量发生变化，致伤原因不同，其变化方式不同。角膜碱烧伤和热烧伤后于7d时出现TGFβ2高峰，说明此时角膜处于免疫功能抑制状态，这对于维持角膜前房的免疫赦免状态非常重要，证明此时机体发挥了自我保护功能，避免产生过度的病理反应。角膜酸烧伤后TGFβ2水平始终低平，其原因尚有待于进一步研究。

【关键词】转化生长因子β2；角膜；碱烧伤；酸烧伤；热烧伤

　　ExpressionofTGFβ2inrataqueoushumorfollowingcornealalkaliburns,acidburnsandthermalburns

　　XueLi,JinTangXu,HaoCui,QiHu

　　Foundationitem:NaturalScienceFoundationofScienceandTechnologyOfficeofHeilongjiangProvince（No.QC05C42）

　　1DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,HeilongjiangProvince,China;2DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofMedicalInstituteJinanUniversity,Guangzhou510632,GuangdongProvince,China

　　Correspondenceto:JinTangXu.DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofMedicalInstituteJinanUniversity,Guangzhou510632,GuangdongProvince,China.jt@jnu.edu.cn

　　AbstractrAIM:TostudytherelationshipbetweenTGFβ2andocularburnsbydetectingthelevelsofTGFβ2inrataqueoushumorfollowingcornealalkaliburns,acidburnsandthermalburnsandtoprovideexperimentalclues.METHODS:Themodelsofalkaliburns,acidburnsandthermalburnsinWistarratswereestablishedandtheanimalsweresacrificedat4,8hours,1,3day,1,2,4and7weeksafterburn.Aqueoushumorwasobtainedbytheanteriorchamberparacentesisandfrozenat70℃.1mol/LHClwasaddedtothesamplestoacidactivation.ThelevelsofTGFβ2wereassessedwithaspecificcaptureELISAkit.RESULTS:ThelevelsofTGFβ2inrataqueoushumorfollowingcornealalkaliburnsincreasedat4hoursafterinjuryanddecreasedquickly.Thesecondincreasewasappearedat3days,reachedtothepeakat1weekandcamebacktothenormalat7weeks.ThelevelsofTGFβ2inrataqueoushumorfollowingcornealacidburnsincreasedat4hoursafterinjuryanddecreasedquickly.Therewassignificantdifferencecomparedtothecontrol.ThelevelsofTGFβ2increasedtothenormalat1weekandlastedlowexpressionasfaras7weeks.ThelevelsofTGFβ2inrataqueoushumorfollowingcornealthermalburnsincreasedat4hoursafterinjuryanddecreasedquicklytothelowestexpressionat1day.Weobservedthesecondincreaseat3daysanditlastedhigherexpressionforlongtime.CONCLUSION:ThelevelsofTGFβ2inrataqueoushumorchangesfollowingocularburns.Thereisdifferenceamongdifferentburns.ThelevelsofTGFβ2speakappearsrespectivelyat1weekfollowingalkaliburnsandthermalburnsshowthecorneabeinimmunosuppressivestatethistimeanditisveryimportanttomaintaintheimmuneprivilegedstatusoftheanteriorchamber.Itisprovedthattheselfsafeguardofthebodyavoidsexcessivepathologicalreaction.ThereasonoflowlevelsofTGFβ2followingacidburnsneedsmorestudy.r　　KEYWORDS:TGFβ2;cornea;alkaliburn;acidburn;thermalburn

眼前房是典型的免疫赦免部位，保护精细的眼部组织避免免疫的损害，对外来抗原的刺激产生独特的免疫反应，这主要是因为：（1）血房水屏障的存在，限制血液中的细胞和分子进入眼内，从而减少特异性和非特异性的免疫反应发生；（2）角膜无血管和淋巴管；（3）房水中有许多细胞因子，如TGFβ，TNFα，IL1，IFN等，在完成房水的生理功能方面发挥着重要的调控作用[1]。目前认为，维持眼的免疫抑制环境，保持前房的免疫赦免特性，与房水中的抑制性免疫调节因子TGFβ，特别是TGFβ2密切相关[2,3]。Cousins等[4]用点杂交法证明房水中有TGFβ存在，其中80%~90%是TGFβ2，它在房水中的浓度高于血清，这对于维持前房的免疫赦免状态非常重要。许多研究业已证实，角膜碱烧伤后无论是在体液免疫方面还是在细胞免疫方面都表现为过度的免疫应答[57]。为了研究角膜碱、酸、热烧伤后TGFβ2在眼内环境中的作用，我们利用ELISA方法检测三种烧伤后房水中TGFβ2含量的变化。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Wistar大鼠125只，体质量250g~260g，购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。大鼠TGFβ2ELISA试剂盒（上海森雄公司），洗涤液（重蒸水1∶20稀释），20g/L牛血清白蛋白（BSA）（Promega），1mol/LHCl，1mol/LNaOH等。

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组

　　按照随机数字表法分为正常对照组、碱烧伤组、酸烧伤组和热烧伤组，其中正常对照组5只，碱、酸、热烧伤组各40只。角膜烧伤组再根据烧伤后不同时间段4,8h;1,3,7,14,28,49d分为8组，每组5只。

　　1.2.2大鼠角膜中度烧伤动物模型制备

　角膜碱烧伤模型：大鼠乙醚麻醉后，取直径为5mm的单层滤纸，浸入到1mol/LNaOH中10s，将浸碱的滤纸贴在大鼠双眼角膜中央部60s，除去滤纸，用生理盐水冲洗5min。双眼结膜囊内涂5g/L红霉素眼膏和10g/L阿托品眼膏。角膜酸烧伤模型：大鼠乙醚麻醉后，取直径为5mm的单层滤纸，浸入到0.5mol/LH2SO4中10s，将浸酸的滤纸贴在大鼠双眼角膜中央部60s，除去滤纸，用生理盐水冲洗5min。双眼结膜囊内涂5g/L红霉素眼膏和10g/L阿托品眼膏。角膜热烧伤模型：大鼠乙醚麻醉后，取直径为5mm的铁片，厚度为1mm,酒精灯加热30s，置于大鼠角膜中央约30s。双眼结膜囊内涂5g/L红霉素眼膏和10g/L阿托品眼膏。

　　1.2.3大鼠前房水标本采集

　　分别于角膜酸、碱、热烧伤后各时间段将大鼠麻醉，于角膜缘内偏下方将20g/LBSA包被的毛细管刺入角膜，吸取前房房水，用吸球吹入20g/LBSA包被的Eppendof管内，70℃保存。

　　1.2.4样品和标准品酸激活处理

　　将450μL样品稀释液加入到一支1.5mL聚丙烯管中，再加10μL房水。加20μL1mol/LHCL，盖紧，上下混匀。4℃放置60min。加20μL1mol/LNaOH，盖紧，上下混匀。

　　1.2.5ELISA方法检测前房水中TGFβ2的含量

　　建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100μL，第1孔加标准品100μL，混匀后用加样器吸出100μL，移至第2孔。如此反复作对倍稀释至第7孔，最后从第7孔吸出100μL弃去，使之体积均为100μL。第8孔为空白对照。检测：待测孔中每孔加入已激活待测房水100μL，将反应板置37℃2h，用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，在滤纸上印干。每孔中加入第一抗体工作液50μL，将反应板充分混匀后置37℃1h，用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，在滤纸上印干。每孔加酶标抗体工作液100μL，将反应板置37℃1h。洗板。每孔加底物工作液100μL，置37℃暗处反应5~10min。每孔加入1滴终止液混匀，在492nm处测吸光值。结果计算：以标准品2000,1000,500,250,125,62.5,32,0ng/L的A值作图，画出标准曲线，根据样品的A值在该曲线图上查出该样品相应的TGFβ2的含量。

统计学处理：所得数据应用SPSS10.0统计分析软件进行处理，统计学方法采用方差分析（F检验）。

大鼠角膜烧伤后前房水中TGFβ2的含量变化：（1）碱烧伤：大鼠角膜碱烧伤后4hTGFβ2的水平呈现一过性升高，然后下降，3d时TGFβ2含量再次升高，7d时达高峰，持续至49d时降至正常（图1）。（2）酸烧伤:角膜酸烧伤后4hTGFβ2的水平呈现一过性升高，然后下降，低于正常对照，两者差异显著。7d时房水中TGFβ2升至正常，然后一直保持低平状态。第49d时我们检测房水中TGFβ2水平仍低于正常（图2）。（3）热烧伤:角膜热烧伤后4hTGFβ2的水平有一过性升高，1d时降至最低，3d时开始增长，直到7d时我们检测仍高于正常，然后缓慢下降（图3）。而不同时间房水中TGFβ2含量变化（图4）。

Benezra等[8]首次报道在体外，正常新鲜的房水对应用促细胞分裂剂处理的淋巴细胞的增生有抑制作用。Kaiser等[9]发现房水可以抑制抗原刺激的T细胞的活化、增殖和分泌细胞因子。在房水的诸多生物活性中，发挥作用的主要成分是TGFβ2。房水中的TGFβ2在正常情况下，绝大部分以无活性的形式存在，激活后的TGFβ2才能发挥其相应的作用[10]。关于人眼组织中TGFβ2的来源，一般认为是眼组织的虹膜和睫状体上皮细胞、视网膜的色素上皮细胞自身合成的而不是由血循环中TGFβ2渗透所致。　　TGFβ2在正常眼中的含量还不确定，但人们已经注意到一些疾病时其含量会有变化。本实验发现在角膜碱、酸、热烧伤后前房水中TGFβ2含量发生变化。大鼠角膜碱烧伤后4hTGFβ2的水平呈现一过性升高，然后下降，3d时TGFβ2含量再次升高，7d时达高峰，持续至第14d时仍高于正常，49d时降至正常水平。在以往的研究中我们已了解角膜碱烧伤是一个以过度的免疫应答为特点的病理性损伤过程，在这一过程中，许多细胞因子均发生了不同的变化。Sotozono等[11,12]利用RTPCR方法研究发现小鼠角膜碱烧伤后早期IL1和IL6mRNA合成大幅度增强，分别在3d和7d达到峰值（53.2pg/cornea和23.6pg/cornea）。Planck等[13]利用RTPCR方法比较了角膜碱烧伤与角膜切割伤后1h到14d期间细胞因子的变化，发现两种角膜损伤的细胞因子表达有所不同，IL1α,TNFα和TGFβ1在两种损伤的角膜上均可检测到，但只有碱烧伤的角膜IL6和IL1β在伤后1~7d持续存在且mRNA水平显著增加。这说明角膜碱烧伤与角膜切割伤所产生的细胞因子不完全一样，两者虽均系外伤，但其发病机制应有不同。

　Miyamo等[14]在角膜碱烧伤后3~14d用ELISA检测了IL1α、IL1β、IL6在视网膜的表达，结果显示IL1β、IL6在烧伤后3d显著增加，以IL6增加明显，第7d降至正常，而IL1α水平始终低于检测敏感度。IL1和IL6均是单核巨噬细胞产生的细胞因子。IL1具有较强的介导炎症的作用，能刺激PMN的趋化能力，促进PMN和血小板粘附到血管内皮细胞，从而浸润到角膜，这些细胞能够产生胶原酶、前列腺素、超氧化物，使角膜溶解。Drost等[15]发现IL1存在于烧伤患者的血清中，并呈升高趋势，但与感染无明显关系。IL1还能诱导创伤处成纤维细胞产生IL8和基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）[16]。IL6是急性期反应的重要介质，能诱导肝细胞产生急性期蛋白，诱导活化B淋巴细胞产生抗体，诱发T淋巴细胞增殖，IL6的大量释放对患者是个危险信号。角膜碱烧伤后IL1和IL6表达增高说明碱烧伤后眼的免疫微环境紊乱，表现为过度的炎症反应。在正常眼的内环境中，TGFβ2被认为是一种免疫调节剂，能调节免疫细胞和某些细胞因子的活性。它能够抑制IL1诱导的单核细胞和成纤维细胞产生IL6[1720]，抑制IL2诱导的T细胞增殖[21]，介导抗原特异性激活的T细胞生成，通过非抗原特异性机制抑制DTHT细胞介导的炎症反应，另外，它还能调节TNFα对细胞毒性T细胞的影响，抑制房水中淋巴细胞的活化和增殖[22,23]。因此，我们认为眼碱烧伤时TGFβ2水平升高是对IL1，IL6等细胞因子变化的反馈应答。机体内多种细胞因子和受体可以互相影响，互相制约，从而构成了一个复杂的、完整的细胞因子网络，共同调节细胞和组织的正常生理和病理过程。碱烧伤时IL1，IL6，TNF等表达增加，反馈性刺激虹膜和睫状体上皮细胞合成和分泌TGFβ2或激活TGFβ2前体，从而抑制IL1，IL6等分泌，抑制TNF表达，减轻炎症反应。TGFβ2水平在3d时增高，7d时达到高峰，与IL1和IL6的变化相吻合。　　角膜热烧伤时TGFβ2的变化过程与碱烧伤类似，伤后4hTGFβ2的水平有一过性升高，1d时降至最低，3d时开始增长，直到7d时我们检测仍高于正常，之后缓慢下降，高水平状态持续时间较碱烧伤短（图3,4）。14d后TGFβ2水平处于低平状态，甚至低于正常，我们推测与TGFβ2的负反馈抑制有关。烧伤后4hTGFβ2的短暂升高我们认为是在应激状态下，虹膜、睫状体等受某些炎性介质作用反应性地增加TGFβ2的分泌或激活TGFβ前体复合物，使之具有生物活性，随着炎症反应的加重和烧伤对虹膜睫状体的破坏，TGFβ2合成减少，之后在组织蛋白酶D和纤维蛋白溶解酶的作用下，大量潜伏状态的TGFβ2被激活[24]，随病程进展，TGFβ2在负反馈机制作用下，表达减弱，低于正常。热烧伤后TGFβ2高水平表达时间较碱烧伤短与热烧伤后的炎症反应轻于碱烧伤有关。　　角膜酸烧伤后TGFβ2的含量变化不同于前两者。酸烧伤后4hTGFβ2的水平应激性地呈现一过性升高，然后下降，7d时房水中TGFβ2才升至正常，然后一直保持低平状态，第49d时我们检测房水中TGFβ2水平仍低于正常。在角膜酸烧伤3d时没有出现TGFβ2的高峰我们认为与TGFβ2未被大量激活有关。从我们前一部分的研究中[25,26]发现无论是在粘附分子变化方面还是在角膜蛋白甚至基因合成方面，角膜酸烧伤均轻于碱烧伤和热烧伤，溃疡发生率低，炎性介质和各种蛋白酶分泌少，因此潜伏的TGFβ2未被大量活化。但对于在伤后7d甚至49d时TGFβ2始终处于低平状态，而且低于正常的原因，我们还不能提出合理的解释。TGFβ2在角膜酸烧伤中的作用机制还需要深入探讨和进一步研究。　　角膜烧伤后房水中TGFβ2水平发生变化，致伤原因不同，其变化方式不同。角膜碱烧伤和热烧伤后于7d时出现TGFβ2高峰，说明此时角膜处于免疫功能抑制状态，这对于维持角膜前房的免疫赦免状态非常重要，证明此时机体发挥了自我保护功能，避免产生过度的病理反应。角膜酸烧伤后TGFβ2水平始终低平，其原因尚有待于进一步研究。

【参考文献】　　1LiX,GaoXW,RenB.TGFβandsimultaneousimmunesuspressionofkeratoplasty.IntJOphthalmol（GuojiYankeZazhi）2007;7（1）:165167

　　2TripathiRC,LiJ,BorisuthNS,etal.TrabecularcellsoftheeyeexpressmessengerRNAfortransforminggrowthfactorbeta1andsecretethiscytokine.InvestOphthalmolVisSci1993;34（8）:25622569

　　3TripathiRC,ChanWF,LiJ,etal.TrabecularcellsexpresstheTGFbeta2geneandsecretethecytokine.ExpEyeRes1994;58（5）:523528

　　4CousinsSW,TrattleWB,StreileinJW.Immuneprivilegeandsuppressionofimmunogeniinflammationintheanteriorchamberoftheeye.CurrEyeRes1991;10（4）:287297

　　5赵敏，陈家祺，杨培增.鼠角膜碱烧伤的免疫学研究.中华眼科杂志2000;36:4042

　　6MiyamotoF,SotozonoC,IkedaT,etal.Retinalcytokineresponseinmousealkaliburnedeye.OphthalmicRes1998;30（3）:168171