溶血性贫血

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血液学检验实验指导
实验一、活化凝血时间测定
【实验原理】同试管法ct测定.试验中加入白陶土-脑磷脂的悬液以充分激活因子和??并为凝血反应提供丰富的催化表面,故称为活化凝血时间（ACT）;还可以避免因接触激活阶段的不同结果带来的影响,从而提高了本试验的敏感性和重复性。【试剂】
1.脑磷脂的制备脑磷脂是将兔脑粉中的组织凝血活酶除去参与外源凝血途径的蛋白部分后所得的磷脂,故又称部分凝血活酶.取干燥兔脑粉1.2g加25ml丙酮,放置2h后过滤,将此兔脑粉加氯仿25ml,连续震荡2h,以滤纸过滤,滤液蒸发后为淡黄色蜡状物,刮入玻璃研钵中,加12ml生理盐水研磨成均匀乳剂,以每安瓶0.25ml分装。2.4%白掏土悬液白陶土2g加入50ml生理盐水中,室温保存,用前摇动。3.4%白陶土-脑磷脂悬液将脑磷脂用巴比妥缓冲液作1:50稀释后,再加等量4%白陶土悬液混合而成.4οC可保存3天,用时充分混合。4.巴比妥缓冲液巴比妥钠11.75g、NaCl14.67g、0.1mol/L的HCl430ml,加蒸馏水至2000ml.此缓冲液pH应为7.3,否则影响试验稳定性。【操作方法】
1.在含4%白陶土-脑磷脂悬液0.2ml的试管中注入受检全血0.5,轻轻混匀。2.其余操作同试管法CT测定。【参考值】1.70±0.76（1.14~2.05）min。【临床意义】
1.同试管法CT测定,但较其敏感,重复性也较好,可检出因子Ⅷ:C小于45%的亚临床型血友病。2.是监测体外循环肝素用量的良好指标之一。实验二、血浆游离血红蛋白测定（邻一甲联苯胺法）
【实验原理】邻一甲联苯胺在酸性溶液中和过氧化氢与血红蛋白共同作用生成氧化型联苯胺,产生绿色→蓝色→紫色,其颜色的深浅与血浆游离血红蛋白的含量呈正相关。【试剂】
1.2g/L邻一甲联苯胺溶液称取邻一甲联苯胺0.2g,溶于冰醋酸60ml,加蒸馏水至100ml,置于棕色瓶内于冰箱保存,色变暗应重配。2.1%过氧化氢溶液用30%过氧化氢原液新鲜配制。3.10%冰醋酸溶液.取10ml冰醋酸,加蒸馏水至100ml。4.血红蛋白应用标准液将血红蛋白贮存液用生理盐水稀释成10mg/100ml备用。5.抗凝试管取0.2ml100U/ml肝素于试管内,在80℃以下烘干,每管可抗凝2ml全血。【操作方法】
1.将抗凝全血分离血浆。2.取试管3支,分别标明测定、标准和空白,分别加入血浆、应用标准液,再向
各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氢溶液各1.0ml,充分混匀,放置10min。3.于上述3支试管内分别加入10%冰醋酸溶液10ml混匀,用435nm波长比色,以空白调"0",读各管吸光度。4.计算:
测定管吸光度
游离Hb（mg/L）100
标准管吸光度
【质量控制】
1.一切容器均应避免血红蛋白污染,标本勿溶血,否则可引起假阳性。2.过氧化氢溶液浓度要准,新鲜配制。3.联苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超过30%,否则均可引起吸光度降低。4.标准液的加入量一定要准。【参考区间】溶血性贫血、镰状细胞贫血及地中海贫血时血浆游离血红蛋白可轻度或中度增加.血管外溶血则正常。实验三、血清结合珠蛋白测定（比色法）
【实验原理】血清结合珠蛋白（Hp）是肝脏产生的a2糖蛋白,它与游离的血红蛋白（Hb）具有特殊的亲合力,可形成稳定的Hb-Hp复合物,后者在弱酸性（pH4）条件下,具有过氧化物酶的活性,测其活性可间接反映Hp的含量。【试剂】
1.乙酸缓冲液0.2mol/L（pH4）称取乙酸钠（NaAC・3H2O）2.8g,冰乙酸5.7ml溶解,加蒸馏水至500ml。2.0.1%（V/V）愈创木酚溶液取1ml愈创木酚溶液于500ml乙酸缓冲液中,加蒸馏水至1000ml。3.0.3%过氧化氢溶液临用前配制。4.0.5g/L高铁血红蛋白液。【操作方法】
1.取静脉血分离血清,避免溶血。2.取受检血清0.4ml,与等量高铁Hb溶液混合。3.取上述混合液0.2ml,加入于已预温（25℃）的愈创木酚5ml溶液中,再加入0.5ml0.3%过氧化氢,于25℃水浴内作用8min,注意避光.每份标本均应双份同时测定。4.用蒸馏水调"0"点,440nm处读取吸光度。5.由校正曲线查出受检血清中Hp含量。【质量控制】
1.受检血清要避免溶血。2.电泳时温度不能过高,应把电泳槽置于冷水中电泳.否则电泳效果差,区带不易区分。3.电泳液应经常更换,防止因pH及离子强度改变对电泳效果的影响。【参考区间】0.2~1.9gHb/L。【临床意义】Hp可与Hb结合,以除去血循环中游离的Hb.各种溶血性贫血,无论血管内溶血还是血管外溶血,血清中Hp含量均明显降低,甚至测不出.Hp降低的程度与溶血程度呈正相关,即溶血越严重,血清Hp越低.如果血管内溶血超出Hp的结合能力,即可出现血红蛋白尿.动态监测表明,急性溶血开始,血循环中游离Hb即迅速增加,随着Hb-Hp复合物的有效清除,血清Hp也随之恢复正常,因此血清Hp与游离Hb同时测定对溶血性贫血的诊断及疗效观察均具有重要意义.肝病、传染性单核细胞增多症和先天性无Hp血症,Hp亦降低,故诊断溶贫时应除外上述疾患.感染、创伤、肿瘤、肝外阻塞性黄疸及类固醇激素治疗时Hp可增加,这些情况下Hp正常也不能除外溶血。醋纤膜电泳有助于区别血管内抑或血管外溶血.各种溶血性贫血患者Hp均显著减少,甚至缺如,故电泳后无Hb-Hp区带,而仅有一条未结合的Hb区带.但显著血管内溶血（如PNH）时,还出现一条高铁血红素白蛋白区带,而血管外溶血（如球形红细胞增多症）则无此区带。实验四、尿含铁血黄素试验（Rou'stest）
【实验原理】含铁血黄素中的高铁离子（Fe3+）在酸性环境中与亚铁氰化钾作用,生成蓝色的低铁氰化铁,称为普鲁氏蓝反应。【试剂】
1、20g/L亚铁氰化钾水溶液,用时新鲜配制。2、3%盐酸。【操作方法】取新鲜尿5ml离心沉淀,弃去上清,于沉淀中加入试剂①和②各1ml,混匀.置室温10min,再离心沉淀,取沉淀物显微镜检查。【结果判断】如见到有分散或成堆蓝色颗粒（直径约1~3μm）即为阳性.存在于细胞内更为可信。【质量控制】所用试管、玻片、试剂均应防止铁剂污染,否则出现假阳性.每次试验应做阴性对照.如两种试剂混合后即显深蓝色,提示试剂污染高铁,不宜使用.晨尿阳性率较高。【临床意义】血浆游离血红蛋白经肾小球滤出后,被肾小管上皮细胞吸收、降解,最后形成含铁血黄素,贮存于细胞内.当细胞脱落随尿排出,即成为含铁血黄素尿.正常为阴性.阳性主要见于慢性血管内溶血,尤其以PNH为多见.即使无血红蛋白尿时也可呈阳性.但阴性结果也不能完全排除血管内溶血,因含铁血黄素颗粒的直径需>1μm时才能从镜下见到.急性血管内溶血时,虽可有血红蛋白血症和血红蛋白尿,但还不能形成足够大的含铁血黄素颗粒,需在数日后才阳性,并可持续数周。实验五、红细胞渗透脆性试验
【实验原理】红细胞在低渗盐水中,水分透过细胞膜内渗,使之膨胀破坏而溶血.本试验是测定红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗力,以鉴别某些与红细胞形态有关的溶血性贫血.红细胞对低渗盐水的抵抗力与其表面积和体积的比值有关,厚度越大,该比值越小,即渗透脆性越大;反之,脆性越小.以浓度为横坐标,溶血度为纵坐标绘制曲线,找出50%溶血对应的盐浓度,即红细胞中间脆性（MCF）,后者较敏感。【试剂】171mmol/LNaCl（10g/L）溶液:将100℃烘干的分析纯氯化钠1.0g置于100ml容量瓶中加少量蒸馏水溶解后,再加蒸馏水至刻度处。【操作方法】取12支试管,按5-1分别加入10g/LNaCl和蒸馏水。表5-1红细胞渗透脆性试验操作表（国际单位制）
试管号123456789101112
10g/LNaCl（ml）1.71.61.51.41.31.21.11.00.90.80.70.6
蒸馏水（ml）0.80.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.9
NaClSIg/L6.86.46.05.65.24.84.44.03.63.22.82.4
制mmol/L116.3109.4102.695.888.982.175.268.461.654.747.941.0
浓度旧制（%）0.680.640.600.560.520.480.440.400.360.320.280.24
然后各管立即加入新鲜静脉血各1滴,并从低浓度到高浓度逐管颠倒混匀,室温静置。【结果判断】静置室温2h,观察结果,从高浓度开始,上清液呈透明红色而管底有红细胞者为开始溶血管;溶液透明红色,管底完全无红细胞者为完全溶血管。【质量控制】
1.NaCl溶液浓度要准确,故应干燥精称。2.注射器和试管必须清洁干燥。3.应用新鲜静脉血,忌用抗凝血,必要时可用去纤维蛋白血或肝素抗凝血。4.结果不易判断时可离心后观察。5.黄疸病人开始溶血不易观察,严重贫血红细胞太少时均可用等渗盐水将红细胞
洗涤后再配成50%红细胞悬液进行试验。6.每次试验均应做正常对照,与被检血相差0.4g/L,即有临床意义。【参考区间】开始溶血:71.8~78.6mmol/L（4.2~4.6g/L）
完全溶血:47.8~54.7mmol/L（2.8~3.2g/L）
中间脆性:68.5~76.2mmol/L
【临床意义】患者比正常对照高6.8mmol/L或中间脆性>76.2mmol/L有诊断价值。脆性增加:见于遗传性球形红细胞增多症,也见于自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞增多者。脆性降低:见于缺铁性贫血,各型地中海贫血,HbC、D、E病,脾切除术后及阻塞性黄疸等。实验六、酸溶血试验（Ham'stest）
【实验原理】正常人红细胞在酸化（pH6.6~6.8）的自身新鲜血清中（内含补体和备解素）,经37℃孵育1h不溶血.而阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）患者,因红细胞膜缺陷,对补体溶血效应敏感性增强,则发生溶血。【试剂】
1.0.2mol/LHCl。2.8.5g/LNaCl溶液。【操作方法】
1.配制50%红细胞悬液取10ml离心管2支,标明患者、对照,均加入8.5g/LNaCl溶液5~6ml,分别加入患者和对照者未梢血十几滴,混匀,离心后弃去上清,如此重复洗涤红细胞2次,最后配成50%红细胞悬液备用。2.分离正常对照血清取与患者同型或AB型血3~5ml,待自然凝固后分离血清。3.按表6-1操作。表6-1酸溶血试验操作表
正常对50%红细胞0.2mol/L
管别孵育
照血清悬液（ml）HCl（ml）
患者对照试验管0.50.0250.0537℃
对照管0.50.0250.05水溶Ih
【结果判断】试验管溶血,对照管不溶血为阳性;试验管和对照管均不溶血为阴性。【质量控制】
1.血清酸化后试管必须塞紧,否则CO2逸出使血清酸度降低。2.抗凝剂中的Na、K可影响pH,故不宜用抗凝血,但可用脱纤维血。3.为保证补体充足,最好用混合血清,但正常对照红细胞必须用"O"型血。4.多次输血者,可因血中异常红细胞相对减少,本试验可呈弱阳性或阴性。【临床意义】正常人为阴性.阳性见于PNH.遗传性球形红细胞增多症及自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性.主要与红细胞球形化有关.血清加热破坏补体,若本试验转为阴性则更支持PNH。实验七、蔗糖溶血试验
【实验原理】低离子强度的等渗蔗糖溶液,在温育条件下可促进补体与红细胞膜的
结合,使红细胞对补体损伤的敏感性增强而导致溶血。【试剂】92.4g/L蔗糖溶液。【操作方法】取新鲜抗凝血（枸橼酸盐或草酸盐抗凝）0.5ml加入4.5ml蔗糖溶液中,混匀,置37℃孵育箱内30min后离心,上清液呈红色为阳性,无色为阴性。【质量控制】注射器、试管应清洁干燥,避免溶血.无蔗糖可用10%葡萄糖代替。【临床意义】正常人为阴性.阳性见于PNH.本试验较Ham试验敏感,是PNH诊断的筛选试验,但特异性较差.再障-PNH综合征、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性.本试验最好与Ham试验同时操作,用正常血清代替患者血清做试验,可除外患者补体异常所致的假阴性。实验八、热溶血试验
【实验原理】利用患者的红细胞和自身新鲜血清（含补体）,经37℃孵育后,由于葡萄糖分解产酸,使有内在缺陷的红细胞溶解而溶血。【操作方法】抽取静脉血1-2ml,取下针头,沿管壁缓缓注入小试管内,避免产生气泡,置37℃孵育箱保温24h,取出后离心.上清呈红色（溶血）为阳性。【质量控制】注射器要干燥,小试管要清洁,操作过程中避免溶血,防止出现假阳性.孵育24h血块未回缩者,可用小玻棒沿管壁轻轻分离,然后离心,观察结果。【临床意义】正常人为阴性.阳性见于PNH,其他溶血性贫血亦呈阳性,但阳性率比PNH为低.本试验用于PNH的筛选。实验九、高铁血红蛋白还原试验
一、比色定量法
【实验原理】6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）在戊糖旁路中使6-磷酸葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖酸,同时催化氧化型辅酶II（NADP）形成还原型辅酶II（NADPH）,再使氧化型谷胱甘肽（GSSG）形成还原型谷胱甘肽（GSH）.NADPH是高铁血红蛋白还原酶的辅酶,在递氢体美兰和高铁血红蛋白还原酶的作用下,使暗褐色的高铁血红蛋白还原为红色的血红蛋白.当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时,高铁血红蛋白还原速度减慢,甚至不能还原。【试剂】
1.12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液亚硝酸钠1.25g,葡萄糖5g,加蒸馏水至100ml.置棕色瓶内4οC下可保存1个月。2.0.0004mol/L美蓝溶液美蓝15mg放乳钵中,加少量蒸馏水研磨后过滤,再加蒸馏水至100ml.室温可保存1~2个月。3.0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）取Na2HPO4229.5mg,KH2PO452.2mg,加蒸馏水至100ml。【操作方法】
1.静脉采血1.5-2.0ml,加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内（血:抗凝剂=9:1）,再加葡萄糖20mg摇匀。2.取血液1.0ml,加亚硝酸钠-葡萄糖溶液和美蓝溶液各0.05ml,颠倒混合12次,使与空气中的氧充分接触.加塞,37±0.5οC水浴（或孵箱）保温3h。3.取出后摇匀,取0.1ml加于10ml磷酸盐缓冲液中溶解,2min后于波长635nm处（或红色滤光板）比色,用蒸馏水作空白,测其吸光度（A）。4.另取原血液0.1ml,按上法加缓冲液溶解后比色,测其吸光度（B）.再于此液中加亚硝酸钠-葡萄糖液1滴,摇匀,5min后比色,测其吸光度（S）。【计算】
A-B
高铁血红蛋白还原率%=（1-―――）*100
S-B
【参考区间】高铁血红蛋白还原率>75%（比色法）
【质量控制】
1.红细胞比积低于30%时,高铁血红蛋白还原率显著降低,必须调整红细胞与血浆的比例。2.本试验抗凝剂若用ACD保养液时,该保养液与血液之比为0.15:1.该抗凝血可保存1周.因草酸盐具有还原性,不宜使用。3.标本不应有凝块或溶血,以免影响测定结果。4.测定吸光度时,分光光度计的波长应准确.一般要求S比B大8倍以上。【临床意义】
本试验用于G6PD缺乏症的过筛检查,蚕豆病和伯氨喹啉型药物溶血性贫血患者,由于G6PD缺陷（隐性遗传）,高铁血红蛋白还原率明显下降.杂合子型多在74%~31%之间,纯合子型常在30%以下。二、细胞化学法
【实验原理】红细胞内血红蛋白可被亚硝酸钠氧化为高铁血红蛋白,后者可经美兰还原为血红蛋白;G6PD缺乏时则高铁血红蛋白不被还原.加入氰化物后形成氰化高铁血红蛋白,易被过氧化氢洗脱,染色后形成空影红细胞.正常的红细胞,氧合血红蛋白的过氧化酶活性,不被氰化物抑制,阻止了枸椽酸盐的洗脱作用,保证红细胞的正常形态。【试剂】
1.反应试剂取0.0004mol/L美蓝溶液1ml,12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液0.5ml,生理盐水8.5ml,混匀.此液于冰箱中可放置1周。2.0.4mol/L氰化钠（或氰化钾）。3.洗脱液95%酒精40.0ml,0.2mol/L枸椽酸8.0ml,30%H2O22.5ml,混匀。4.固定液甲醇
5.染液5g/L苏木素液,4g/L伊红液。【操作方法】
1.取ACD抗凝血0.05ml,置于预先盛有0.05ml反应试剂之小试管中,摇匀,放37C水浴（或孵箱）中保存4h。2.取出后用滴管轻轻吸去上清液,于剩下的红细胞中加入0.4mol/L氰化钠0.005ml（细玻棒蘸起一小滴）,摇匀。3.5min后加入1滴患者血浆（或AB型血浆）,用滴管混匀,取出1滴作薄涂片,待干。4.将玻片放入盛有洗脱液的染色缸内,上下移动1min,再静置于液中2~4min,取出后甲醇固定半分钟,水冲洗,待干。5.用苏木素染2~3min,水冲洗,再以伊红染1~4min水冲洗,待干。6.在高倍镜下观察,计数1000个红细胞（涂片四角及中央各数200个）,算出G6PD缺乏红细胞（空影红细胞）的百分率。【质量控制】本法受洗脱液H2O2浓度的影响,因H2O2易分解,不易保存所需浓度,因此使用过程中宜随时补充少量H2O2.补充的量依使用次数的多少、放置时间和室温高低而定,需凭经验掌握,最好用阴性、阳性样本对比试验来确定。【临床意义】正常人空影红细胞88.0%,杂合子0.4%~88%.此法对于杂合子的检出敏感性较高,但作为筛选法则过于繁琐。实验十、变性球蛋白小体检查
【实验原理】氧化物质可使G6PD缺乏患者的红细胞中积蓄多量的H2O2等氧化剂,使血红蛋白氧化变性.而与某些碱性染料（如煌焦油蓝）或结晶紫孵育后形成蓝黑色或紫黑色颗粒定位于红细胞内。【试剂】用0.73%NaCl溶液配制成1%的结晶紫（龙胆紫）溶液。【操作方法】滴1滴试剂于载玻片上,用玻棒或竹签蘸一点患者血液于其上,混匀,加盖玻片,染5~10min后在高倍镜下观察.计算500个红细胞中含变性珠蛋白小体红细胞的百分率。含变性珠蛋白小体的红细胞是在红细胞中出现多个紫黑色、或细或粗、形状不规则的颗粒,位于细胞的边缘或中央,血红蛋白或仍均匀分布,或完全缺如。【参考区间】正常人无变性珠蛋白小体,或偶见几个（溶血性贫血,属常染色体隐性遗传.纯合子时,PK活性显著降低;杂合子时,无贫血症状,但酶活性降低,介于正常人和纯合子之间。实验十五、自身溶血试验及纠正试验
【实验原理】将肝素抗凝血置37℃孵育48h,观察自然溶血程度,并结合加葡萄糖及ATP纠正试验,协助遗传性球形红细胞增多症的诊断,并鉴定其类型。【试剂】
1.10%葡萄糖（无菌）。2.等渗盐水（无菌）。3.0.4mol/LATP生理盐水无菌液。4.0.4g/L氨水（浓氨水0.16ml加水至100ml）或HiCN转化液。【操作方法】
1.取小试管4支,分别加1g/L肝素0.02ml,3.624kg（8磅）15min高压灭菌,烘干。2.取静脉血4ml,以无菌手续按表15-1加入各管,混合抗凝,然后依次操作。3.以冷藏血离心后的血浆0.2ml加0.4g/L氨水或转化液4.8ml为空白对照管,在540nm处测各管吸光度A值。4.计算各管溶血率（相当于空白对照管100%的比值）。测定管A*（1-红细胞压积）
测定管溶血率=
溶血对照管A*4
【质量控制】操作过程严格无菌。【临床意义】正常人血液无菌时孵育48h后溶血率很低,一般溶血性贫血溶血率不同程度增强.遗传性球形红细胞增多症自身溶血早而明显,能被葡萄糖纠正.遗传性非球形红细胞溶血性贫血,自身溶血增加,其中1型因6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性降低,能被葡萄糖和ATP纠正;Ⅱ型表15-1自身溶血试验操作表
123溶血对照
肝素抗凝血（ml）1.01.01.01.0
10%葡萄糖（ml）0.05
0.4mol/LATP（ml）0.05――
9g/LNaCl（ml）0.05―
37℃孵育48小时测红细胞压积4℃冷藏
孵育血浆（ml）0.20.20.2全血0.1
0.4g/L氨水或
4.84.84.89.9
HiCN转化液（ml）
系丙酮酸激酶缺乏,溶血不能被葡萄糖纠正,但能被ATP纠正.PNH、自身免疫性溶血性贫血、药物性溶血等均不能被葡萄糖纠正.大部分不稳定血红蛋白病例自身溶血率轻度增加,加葡萄糖1型可以纠正,Ⅱ型则不能纠正。实验十六、血红蛋白电泳
【实验原理】利用各种血红蛋白（包括正常或异常Hb）珠蛋白及等电点不同,在一定电场和pH缓冲液中电泳方向和速度亦不相同,Hb与等电点缓冲液的pH差别越大,Hb电泳速度越快;相反则电泳速度越慢.采用不同的缓冲液,支持介质和电泳仪其分辨率不同.以此来判断异常Hb的性质,为诊断异常Hb病提供依据。在电泳中,因所用支持物不同,而有纸上电泳、琼脂电泳、淀粉胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等.电泳胶分辨率较高,但制板较费时且不方便,琼脂凝胶电泳应用于某些异常Hb的分辨.醋酸纤维素膜电泳方法简便,省时,易于洗脱定量,对异常Hb分辨率较好,适于一般试验室作为异常Hb的筛选试验.在缓冲液选择上,多以碱性（pH8.5或9.1）缓冲液浸泡薄膜,用硼酸盐缓冲液进行电泳筛选.必要时再用pH6~6.2缓冲液电泳鉴别。【试剂】
1.0.26mol/LTris缓冲液（pH9.1）（用于阳极）三羟甲基氨基甲烷25.2g,EDTA2.5g或EDTA-Na22.83g,硼酸1.9g,加蒸馏水至1000ml。2.巴比妥缓冲液（pH8.6）（阴极）巴比妥钠5.15g,巴比妥0.92g,加蒸馏水至1000ml。3.醋酸纤维素薄膜浸泡液①、②两种缓冲液等量混合。4.氨基黑10B染色液氨基黑10B1g,磺基水杨酸10g,冰醋酸20ml,加蒸馏水至400ml。5.漂洗液乙醇45ml,冰醋酸5ml,蒸馏水50ml混合。6.透明液冰醋酸25ml,无水乙醇75ml。7.0.4mol/LNaOH。【Hb液的制备】将抗凝血离心去血浆,加生理盐水洗涤3次.每ml红细胞加1.4ml蒸馏水和0.4ml四氯化碳,强烈振摇5min,离心后取上清液于4℃冰箱保存备用（不适用于不稳定血红蛋白检查）。【操作方法】
1.电泳槽内阳极注入pH9.1的Tris缓冲液;阴极注入pH8.6的巴比妥缓冲液,要求两极液面平行。2.醋酸纤维素薄膜切成12*4cm的条状,置于浸泡液内10min后取出,用滤纸吸去多余液体,使粗面朝上,贴于电泳槽的支架上,用两层纱布搭桥,自然平衡5min。3.用Hb吸管吸取2~3μl10%Hb液,放在盖玻片上（长约1cm）边缘,使之印在靠阴极端1.5cm薄膜片处,薄膜下衬一张干燥滤纸以吸去多余的Hb液,同时用正常人血红蛋白液做对照。4.接通电源,平衡5min后,调电压至150v,电流0.2mA/cm薄膜宽,电泳15~30min.取下薄膜条,置于氨基黑10B染液中,10min后取出,用漂洗液至薄膜条洁白为止。5.定量测定将各小区带剪下,HbA1用20ml0.4mol/LNaOH脱色,HbA2用4ml0.4mol/LNaOH脱色.另取一条无色膜条（与HbA2带相仿大小）,加0.4mol/LNaOH液4ml作为空白,用分光光度计,在640nm处比色,记录吸光度,按下式求其含量（%）。HbA2吸光度
HbA2（100
HbA2吸光度+HbA1吸光度*5
【质量控制】
1.醋酸纤维素薄膜应在浸膜液中浸透。2.防止被检血红蛋白以外的标本污染薄膜。3.为保证电泳效果,电泳槽内缓冲液最多使用两次。【参考区间】1.1%~3.2%。【临床意义】
HbA2增高是轻型地中海贫血的重要特征.此外,巨幼红细胞性贫血,恶性贫血,某些不稳定血红蛋白等,HbA2也相对增高.在电泳分组中,以HbA为标志,较HbA快者包括H组和J组,属快速异常Hb
HbA2减低见于缺铁性贫血及铁粒幼红细胞性贫血等。实验十七、抗碱血红蛋白（HbF）测定
【实验原理】抗碱血红蛋白具有抗碱变性的能力,在碱性溶液中不易变性沉淀,其他Hb在碱性溶液中可变性而被沉淀剂沉淀,测其滤液中Hb含量即HbF的含量。【试剂】
1.0.083mol/LKOH4℃保存,用前应滴定校正.若有沉淀或混浊应弃去。2.半饱和硫酸铵取饱和硫酸铵（约390g/500ml）4ml,加蒸馏水4ml及1mol/L盐酸0.2ml。【操作方法】
1.Hb液的制备取抗凝血1~2ml,用等渗盐水离心沉淀,洗涤红细胞2~3次.然后向洗涤的红细胞中加入蒸馏水和四氯化碳（或氯仿、甲苯）,其比例是1∶1.5∶0.5,用力振荡5~6min,离心20min,上层透明液即为Hb液（约100g/L）。2.取大试管1支,加0.083mol/LKOH3.2ml,Hb液0.2ml.立即混匀,准确碱化1min,立即加入半饱和硫酸铵6.8ml,混匀后优质滤纸过滤,其滤液为甲液。3.另取试管1支,加蒸馏水4ml,Hb液0.02ml,混匀后为乙液。4.以蒸馏水作空白,在500nm处,测甲、乙液的吸光度（A）值。5.计算
甲液A值51
抗碱血红蛋白（100
乙液A值201
式中51和201分别为甲、乙Hb液的稀释倍数。【质量控制】
1.KOH浓度必须准确,pH应>12,校正后最好小瓶密封,使用量及作用时间必须十分准确。2.半饱和硫酸铵必须准确配制,其pH应为3.0,最好小批量分装。3.试验所用试管、吸管、仪器均不能污染酸碱,
4.过滤纸应为优质,型号必须稳定,滤液应清晰透明,否则应重新过滤或离心沉淀。5.滤液呈淡黄色或淡红色,可使结果偏高.与所用试剂质量、浓度不足有关。6.每次最好做重复试验。【参考区间】成人1.0%~3.1%.新生儿55%~85%,2~4个月后逐渐下降,1岁左右接近成人水平。【临床意义】β-地中海贫血HbF明显升高,重者可达30%~90%.白血病、淋巴瘤、再障、PNH、真性红细胞增多症等也轻度升高.HbF升高还应结合Hb电泳图谱,以判定是HbF升高,还是HbBart升高。实验十八、HbF酸洗脱试验
【实验原理】HbF除抗碱能力强外,抗酸能力也较强.因此,血片经酸洗脱后,只有含HbF的红细胞不被洗脱而染色。【试剂】
1.80%乙醇固定液
2.0.1mol/L枸橼酸枸橼酸9.6g,加水至500ml。3.0.2mol/L磷酸氢二钠Na2HPO4・12H2O35.81g,加水至500ml。4.枸橼酸一磷酸缓冲液取②液37.7ml与③液12.3ml混合,pH3.3±0.2。5.苏木素染液取1g苏木素溶于10ml无水乙醇中,取2g明矾溶于200ml蒸馏水中,混合后煮沸,加氧化汞0.5g,至成深紫色,放冷水中冷却,次日过滤。6.1%伊红Y溶液200ml中加1滴冰醋酸。【操作方法】
1.取新鲜干燥血涂片置80%乙醇中固定5min,自然干燥.枸橼酸盐抗凝血4℃冰箱保存3日内可以使用。2.将上述处理的血涂片,入37℃pH3.3的缓冲液中5min,取出后流水冲洗,待干。3.苏木素染液染1min,以免误认为阳性红细胞。4.水洗后用伊红染液染1min,水洗,干后镜检。【结果判断】含有HbF的红细胞被伊红染液染成鲜红色,为阳性红细胞;仅留下淡影的红细胞为阴性红细胞.仿网织红细胞计数法,计数1000个红细胞中阳性细胞所占百分率。【质量控制】
1.血涂片要薄,细胞平铺分散.涂片在2h内染色,否则易出现假阳性。2.缓冲液的温度、pH及洗脱时间要严格掌握,否则影响结果.也可用稀释瑞氏染液做对比染色。【临床意义】脐带血几乎所有的红细胞均为阳性;1个月后的婴儿阳性细胞为67%;4~6个月后偶见阳性细胞;成人则多溶血性贫血,亦见于药物免疫性溶血性贫血和同种免疫性溶血性贫血（新生儿溶血病及溶血性输血反应）.制备抗IgG和/或抗补体的特异性Coomb's血清,可将温抗体型自身免疫性溶血性贫血分为三个亚型:①IgG型（24%）;②IgG及C3型（60%）③C3型（12%）.少数患者虽有典型临床表现,并对激素疗效较好,但Coomb's试验为阴性,可能为IgA或IgM型.Coomb's试验的强度与溶血的严重程度无关.间接抗人球蛋白试验最常用于Rh或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病母体血清中不完全抗体的检测.自身免疫性溶血性贫血患者本试验可以阳性,也可以阴性,这主要取决于自身抗体的总量及其与红细胞的亲和力。实验二十、冷凝集素试验
【实验原理】冷凝集素综合征患者血清中的冷凝集素能与自身红细胞、O型红细胞或与患者同型红细胞在0~4οC条件下产生凝集现象.当加热至37οC时,已凝集的红细胞可发生完全可逆性的散开。【试剂】
1.受检者血清。2.正常O型或与受检者同型红细胞,经生理盐水洗涤3次,配成20%红细胞生理盐水悬液。【操作方法】
1.取小试管12支,每管加0.2ml生理盐水。2.取待检血清0.2ml,在上述试管中作对倍稀释.第12管不加血清,作盐水对照。3.每管中加入20%O型红细胞悬液0.2ml,混匀,放4οC冰箱中24h,取出观察结果后,将试管放入37οC水浴30min再观察。【结果判断】在4οC时出现凝集现象,放入37οC30min后凝集现象消失者为阳性.出现凝集的血清最高稀释度的倒数为凝集效价。【参考区间】冷凝集素效价64）.冷凝集素综合征多高达256以上,且此种异常的冷凝集素作用的温度范围也常扩大,有时在30οC时效价仍高,这就很有诊断意义.故如4οC时效价增高不很明显而又疑为本病者,应再用20οC、30οC作试验.为使诊断更明确,应进一步做冷热溶血试验,及冷球蛋白试验,以除外PCH及冷球蛋白血症等冷敏感性疾病。实验二十一、冷热溶血试验
【实验原理】阵发性寒冷性血红蛋白尿（PCH）症患者体内存在一种冷热溶血素,属IgG抗体,当温度低于20οC时,能牢固结合于自身红细胞表面,温度恢复至37οC时,激活补体使红细胞溶解而溶血。【试剂】
1.豚鼠血清。2.生理盐水。【操作方法】
1.取小试管16支,前8支（1~8）为试验组,后8支（9~16）为对照组。2.取新鲜豚鼠血清,以生理盐水稀释10倍。3.取患者静脉血9~10ml,注入盛有小玻璃珠的小三角瓶内,轻轻转摇,至纤维蛋白析出附于玻璃珠上.将去纤维蛋白血低速离心,分离出血浆.红细胞用生理盐水洗涤3次,配成50%红细胞盐水悬液。4.取正常同型血9~10ml,按上法分离血浆和配制50%红细胞盐水悬液。5.按表21-1加入各种反应物.然后将试验组的试管置冰箱中30min,再置37οC水浴中2h.对照组不置于冰箱中,直接放入37οC水浴中2h.离心后观察各管有无溶血。表21-1冷热溶血试验操作步骤
试管号血浆（ml）50%红细胞悬液（ml）豚鼠血清
（ml）生理盐水
（ml）
患者对照患者对照10.5
0.025
0.05
20.5
0.025
0.05
30.5
0.0250.05
40.5
0.025
0.05
5
0.50.025
0.05
6
0.50.025
0.05
7
0.50.0250.05
8
0.5
0.025
0.05
【结果判断】如第一管及第三管溶血,而其它管无溶血,即为阳性结果,说明病人血浆中有冷热溶血素。【临床意义】正常人各管均无溶血.阳性主要见于阵发性寒冷性血红蛋白尿症,是诊断PCH的主要依据.先天性梅毒、水痘、流行性腺腮炎、传染性单核细胞增多症等。实验二十二、血浆复钙时间及纠正试验
【实验原理】血浆复钙时间（RT）又称再钙化时间或血浆凝固时间.在去钙的血
浆中重新加入适量的钙,血浆又复凝固时间。【试剂】
1、0.1mol/L草酸钠称1.34g草酸钠加水至100ml。2、0.025mol/LCaCl2溶液。【操作方法】取血浆（草酸钠抗凝,与血液之比为1∶9）0.1ml,加入0.025mol/LCaCl2溶液0.1ml,混合,立即开动秒表.记录血浆中出现弥漫白色颗粒所用时间.重复2~3次,求均值。【质量控制】CaCl2溶液应新鲜配制,标本应及时测定,以免因凝血因子消耗而影响结果.标本勿溶血,否则钙化时间缩短.不能用EDTA抗凝。【临床意义】正常血浆复钙时间为1.5~3min.其临床意义同凝血时间测定,但较CT敏感、准确,可检出因子Ⅷ∶C5s,提示患者血浆中有肝素或类肝素增多.加入甲苯胺蓝不能纠正者,提示延长的凝血酶时间不是因为肝素类物质增多所致。实验三十一、抗凝血酶Ⅲ测定
一、抗凝血酶Ⅲ抗原测定（火箭电泳法）
【实验原理】以抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）的抗血清制备琼脂糖凝胶板,将受检血浆加入其中一起电泳,抗原抗体相互作用的结果可形成特异火箭样沉淀峰,峰的高度与AT-Ⅲ抗原量呈正比,以此与标准品比较计算出受检者血浆AT-Ⅲ抗原含量,反映受检者血浆的AT-Ⅲ水平。【试剂】
1.抗人AT-Ⅲ抗血清和标准血浆。2.0.05mol/LpH8.2巴比妥盐酸缓冲液。3.0.109mol/L枸橼酸钠。4.1%磷钼酸溶液。【操作方法】
1.常规静脉采血,0.109mol/L枸橼酸钠抗凝,分离PPP,立即检测或低温冰箱存放待测。2.用巴比妥盐酸缓冲液配制1%琼脂糖溶液,置56οC水浴中按需加入抗人AT-Ⅲ抗血清,浇成琼脂糖凝胶板。3.凝固后,在凝胶一侧打加样孔（孔径2mm,孔距5mm）,将标准品用生理盐水作原倍、1:2、1:4、1:8、1:16稀释,待测血浆作1:5稀释后加入琼脂糖凝胶加样孔内（5μl/孔）。4.巴比妥盐酸缓冲液作电泳液,加样孔侧接负极,在140V电压下电泳6~8h。5.电泳毕,将琼脂糖凝胶板浸于1%磷钼酸中,20min后即可观察.测量火箭峰的高度,制出标准血浆直线回归方程,并算出待测样本AT-Ⅲ抗原浓度。【参考值】AT-Ⅲ抗原250~340g/L。【临床意义】AT-Ⅲ抗原水平减低见于先天性AT-Ⅲ缺陷;但更常见于获得性AT-Ⅲ缺陷,如肝脏病变、DIC、血栓性疾病、妊高症等。AT-Ⅲ抗原水平增高可见于血友病、口服抗凝剂治疗、黄体酮应用以及某些血管性疾病等。二、抗凝血酶Ⅲ活性测定（发色底物法）
【实验原理】在肝素存在下,AT-Ⅲ可迅速与凝血酶结合并使之失活.在试验中加入过量凝血酶,使其与受检血浆中的AT-Ⅲ形成1:1复合物,剩余的凝血酶作用于与纤维蛋白原作用位点结构相似的带对硝基苯胺（PNA）显色基团的发色底物S-2238,裂解出PNA,剩余的凝血酶愈多,裂解出的PNA愈多,显色愈深,表示AT-Ⅲ活性愈低。【试剂】
1.S-2238底物（浓度为7.5*10-7mmol/L）。2.10U/ml凝血酶溶液。3.Tris-肝素缓冲液Tris0.05mol/L,EDTA-Na2・2H2O7.5*10-3mol/L,NaCl1.75*10-4mol/L,用1mol/LHCl调至pH8.4,每1000ml缓冲液加入肝素30,000U。标准血浆可用20~30名正常人之混合血浆代替。50%醋酸溶液。【操作方法】
不同厂家合成的底物、试剂盒略有不同,按其说明书操作,大致可分成下列几个步骤。1.常规采血,分离PPP抗凝血浆,即刻检测或置低温冰箱保存。2.以Tris-肝素缓冲液稀释标准血浆和待测血浆。3.稀释后血浆经37οC温育5min,加凝血酶溶液,再于37οC温育30s,最后加底物,温育30s后以50%醋酸中止反应,在波长405nm酶标仪上读出A值。4.制标准血浆直线回归方程,并计算出受检样本血浆的AT-Ⅲ活性。【参考值】AT-Ⅲ活性750~1250U/L。【质量控制】
1.AT-Ⅲ抗原和AT-Ⅲ活性以同时测定为好.两者临床意义相似,但不一定平行,尤其在先天性AT-Ⅲ缺陷时,并非AT-Ⅲ合成量的减少,而是合成了结构异常的AT-Ⅲ分子,测其抗原量正常,而活性减低。2.AT-Ⅲ检测的标准品或受检者血浆不可反复冻融或贮藏于-20οC以上的冰箱,不然可造成AT-Ⅲ抗原含量和活性降低。3.测定前,肝素、凝血酶溶液需置于4οC环境中。【临床意义】同AT-Ⅲ抗原测定。实验三十二、优球蛋白溶解时间（ELT）测定
【实验原理】血浆加入硼酸或醋酸后,可使优球蛋白（包括纤维蛋白原、纤溶酶原和纤溶酶原激活物等）沉淀.经离心后除去纤溶抑制物,并复溶于碱性缓冲液中,再加适量的钙或凝血酶使其凝固.在37℃观察凝块完全溶解所需时间,即为ELT.本试验是测定纤溶活性的筛选试验,具有一定的特异性和准确性。一、加钙法
【试剂】
1.109mmol/L枸橼酸钠溶液。2.硼酸盐缓冲液（pH9.0）硼酸钠1g,NaCl9g,加水至1000ml。3.0.17mol/L乙酸溶液。4.0.025mol/LCaCl2溶液。【操作方法】
1.分离枸橼酸抗凝血浆。2.取尖底离心管1支,加蒸馏水7.5ml,加0.17mmol/L乙酸溶液0.12ml,使pH约为4.5,置冰水浴中。3.加入0.5ml血浆,混匀,继续置冰水浴中10min,3000r/min,离心5min。4.倾去上清液,倒置离心管于滤纸上,吸去残液。5.加硼酸缓冲液0.5ml于沉淀中,置37℃水浴使其溶解。6.加0.025mol/LCaCl2溶液0.5ml,记录凝固时间,置37℃水浴中,观察凝块完全溶解所需时间。【质量控制】第2、3步骤要在15min内完成,观察溶解标本以不见絮状为准,当纤溶极度亢进,纤溶酶原基本被耗尽时,可呈假阴性。二、加酶法
【试剂】
1.凝血酶溶液2U/ml,凝血酶时间在20-22s。2.巴比妥乙酸缓冲液（pH7.4）。原液:巴比妥14.714g,乙酸钠9.714g,加无CO2新鲜蒸馏水至500ml。应用液（pH7.4）:原液5ml,0.1mol/LHCl5ml,生理盐水90ml。3.109mmol/L枸橼酸钠溶液。4.0.17mol/L乙酸溶液。【操作方法】第1-4步操作同加钙法,然后用pH7.4巴比妥乙酸缓冲液0.5ml代替硼酸缓冲液,用凝血酶（2U/ml）0.5ml代替0.025mol/LCaCl2测定。【临床意义】正常ELT加钙法>120min,加酶法为124±24min.ELT缩短（溶血性贫血、巨幼红细胞性贫血、红血病、粒细胞
减少症等。二、血涂片检查
1.低倍镜观察血涂片是否满意。2.油镜计数至少100个白细胞,注意有无特殊细胞及染色情况。3.观察成熟红细胞大小、形态。4.估计血小板数量并注意形态变化。5.有无寄生虫。三、结果分析
根据骨髓象、血象及形态特点,结合临床资料综合分析,提出诊断或参考性意见。四、成人正常骨髓象
骨髓细胞分类参考值见表1-5-2。注:原血细胞数值省略
表1-5-2显示成人正常骨髓中,各细胞系及其各阶段相对含量变化均较大,但分类结果归纳后符合下列情况时,可视为正常骨髓象。1.骨髓增生活跃.
2.粒、红两系比例适当,各阶段的形态染色大致正常.粒系占有核细胞的2/4（0.40-0.60）,其中原始粒细胞溶血性贫血、缺铁性贫血、巨幼红细胞性贫血仅轻度增加。（3）鉴别急性白血病类型.急性粒细胞白血病时PAS染色常呈阴性反应;急性单核细胞白血病多呈强阳性反应,阳性反应物呈弥漫性;急性淋巴细胞白血病常呈强阳性反应,阳性反应物呈颗粒或块状。（4）确认巨核细胞的常用方法.较成熟的巨核细胞多呈强阳性,小巨核细胞也常呈阳性反应。（5）用于Gaucher氏细胞与NiemannPick细胞的鉴别.前者呈强阳性,后者呈阴性或弱阳性。实验四十二、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色
显示磷酸酶的方法有钙-钴法和偶氮偶联法两种,以前者常用予以介绍。【实验原理】碱性磷酸酶在pH9.2-9.8的条件下,能使β-甘油磷酸钠水解,生成磷酸钠,经与钙离子作用生成磷酸钙,再与钴离子作用生成磷酸钴,最后与硫化铵生成黑色硫化钴沉淀,定位于胞浆中。【试剂】
1.孵育液30g/Lβ-甘油磷酸钠5ml,20g/L巴比妥钠5ml,20g/LCaCl210ml,其pH以9.2-9.5为宜。2.20g/L硝酸钴。3.20g/L硫化铵（新鲜配制）,或10ml蒸馏水加硫化铵液4滴混合。4.10g/L伊红。【操作方法】
1.将标本用95%乙醇固定10min,晾干。2.置标本于37℃的孵育液中,保温6~8h。3.加20g/L硝酸钴5min。4.流水冲洗,滴加20g/L硫化铵染5min。5.流水冲洗,加10g/L伊红复染5min。【结果判断】（一）胞浆呈粉红色.（+）胞浆呈淡灰色无颗粒或弥散状灰色沉淀
不足胞浆总面积的1/4.（2+）胞浆呈均匀棕色或致密棕黑色沉淀占胞浆总面积的1/2.（3+）胞浆内充满棕黑色颗粒,但颗粒间有空隙或胞浆内有3/4面积充满致密的黑色颗粒.（4+）全部胞浆充满极致密的黑色颗粒,甚至将核遮盖。计100个成熟中性粒细胞,求阳性细胞的百分率.将所有阳性反应的细胞均换算成
1个"+"强度后的总和求积分值。【质量控制】试剂质量、温度、pH、及固定液对NAP活性均有影响.固定液以95%乙醇（化学纯）为好,孵育液pH以9.4为好,超过此值酶扩散、细胞破坏、影响结果.涂片应新鲜,薄厚适宜,标本存放过久,酶活性降低.涂片经温育后直接加硝酸钴,经水冲洗后阳性程度降低。【临床意义】健康人NAP阳性率一般在40%以下,积分值溶血性贫血、再生障碍性贫血等细胞外铁增加,常为"2+~3+".铁粒幼红细胞也增多,以Ι、Ⅱ为主,其铁颗粒粗大,着色深。2.助诊铁粒幼细胞性贫血环形铁粒幼细胞增多,占幼红细胞的15%或更多,并易见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼红细胞,是诊断铁粒幼细胞性贫血的重要依据。3.骨髓增生异常综合征时铁粒幼细胞增多,其含铁颗粒的数目可增多,环形铁粒
幼细胞易见.RAS患者环形铁粒幼细胞常>15%。实验四十四、贫血
一、增生性贫血
贫血按骨髓增生情况和特点可分为增生性、增性不良性和巨幼细胞性贫血等.增生性贫血包括缺铁性贫血、溶血性贫血、急性失血性贫血和铁粒幼细胞性贫血等.它们的共同特点是:
【骨髓象】增生活跃或明显活跃,有核红细胞增多,粒/红比值降低.红系以中、晚幼红为主,核分裂象亦增多;可见嗜多色性红细胞、点彩红细胞、Howell-Jolly小体和Cabot环等.粒细胞相对减少,巨核细胞无明显增减。【血象】成熟红细胞可有大小不均,并见异形红细胞、嗜多色性红细胞、点彩红细胞、Howel-Jolly小体、Cabot环等,偶见有核红细胞.网织红细胞数增多或正常.白细胞总数正常,也可轻度增高或降低.增高时粒细胞增高或核左移,减少时淋巴细胞相对增加.血小板数正常或稍低。（一）缺铁性贫血（IDA）
缺铁性贫血是最常见的贫血类型,系各种原因引起体内铁缺乏导致血红蛋白合成不足所致.常见于慢性失血（月经过多、痔疮、消化道肿瘤）,需求过多（妊娠、哺乳期）或铁供应不足（营养不良、偏食、胃肠道吸收障碍等）。【骨髓象】增生活跃或明显活跃,幼红细胞增多,以中、晚幼红细胞为主,胞体较小,核固缩,胞浆少,灰蓝色,边缘不整齐.贫血严重者,成熟红细胞呈典型小细胞低色素性改变.粒系相对减少,形态、染色大致正常.粒/红比值降低,巨核细胞无明显改变.骨髓小粒中可染铁消失,铁粒幼红细胞减少或消失。【血象】红细胞和血红蛋白均减少,以后者更明显.贫血较重时红细胞体积减小,中心染色过浅,甚至呈环形红细胞.白细胞总数及分类大致正常,血小板多正常,网织红细胞常轻度增加。缺铁性贫血的诊断可根据病史,典型低色素贫血形态改变及缺铁指标的阳性而获得.对早期缺铁的诊断需借助于其它指标.常用诊断标准为:血清铁蛋白（SF）≤12-20μg/L为贮铁缺乏,如再加上下列三项指标（FEP>1mg/L全血、FEP/Hb>4.5μg/gHb和运铁蛋白饱和度1ng/L.铁剂治疗试验也是确诊本病的方法之一,服铁剂后先有网织红细胞升高,尔后血红蛋白增高.在监测储备铁是否恢复时,SF和FEP恢复正常可作为停药的依据。（二）溶血性贫血
溶贫是某些原因使红细胞寿命缩短,破坏增加并超过骨髓造血代偿能力引起的一类贫血。【骨髓象】增生明显活跃,幼红细胞明显增多,通常在0.40以上,以中幼红细胞为主,核分裂象易见.粒细胞相对减少,形态,染色大致正常.粒/红比值降低,甚至倒置.巨核细胞正常或增多.易见嗜多色性红细胞,常见Howell-Jolly's小体,偶见Cabot环节。【血象】红细胞和血红蛋白成比例减少,为正细胞性贫血.成熟红细胞异形性明显,有时出现球形、椭圆形、靶形、镰形和畸形红细胞等,易见有核红细胞.白细胞和血小板呈反应性增多,且可有核左移现象.网织红细胞明显增多,常可达0.10或更高。溶血性贫血病因复杂,病种较多,单靠骨髓和血象不易鉴别诊断,还须依靠有关实验室检查才能确诊。（三）急性失血性贫血
急性失血性贫血是因创伤或不同疾病所致血管破裂或凝血障碍,使血管内血液短期内丢失而引起的一种贫血.其严重程度随失血量、速度、部位及基本疾病不同而异。【骨髓象】增生活跃或明显活跃,以红系较明显,贫血明显时中幼红细胞增多,其它改变不明显。【血象】为正细胞性贫血,白细胞总数和中性粒细胞增多,并有核左移.网织红细胞增多,血小板亦增多。（四）铁粒幼细胞性贫血（SBA）
铁粒幼细胞性贫血是一组病因不同的血红素合成障碍或铁利用不良引起的一种贫血。【骨髓象】
红系明显增生,以中幼红细胞居多,部分幼红细胞呈巨幼样变,双核,核固缩,胞浆内有空泡.铁染色显示细胞外铁增加,铁粒幼细胞显著增多,有大量环形铁粒幼细胞,可达0.40-0.80为本病之特征.粒细胞一般正常,偶有早幼粒和原始粒细胞增多,符合标准者可诊为骨髓增生异常综合征（MDS）中的难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞增多（RARS）.巨核细胞一般正常。【血象】红细胞具有双形性,表现为正细胞性或轻度大细胞低色素性贫血.网织红细胞正常或稍高,白细胞和血小板多数正常,少数减少。根据红细胞的双形性,骨髓中有大量环形铁粒幼红细胞及铁剂治疗无效,铁粒幼细胞性贫血的诊断并不难.也可表现为血清铁、运铁蛋白饱和度、血浆铁转换率及FEP增高,血清铁结合力、铁利用率、红细胞渗透脆性及中性粒细胞碱性磷酸酶减低等.应注意与其它低色素性贫血的鉴别.当骨髓中原、幼细胞增多时,要警惕向急性白血病转化的可能.对已确诊者可结合临床及治疗反应作出分类诊断。二、增生不良性贫血
增生不良性贫血系多种病因引起的造血干细胞或造血微环境受损及免疫机制紊乱所致红骨髓容量减少的一组贫血.再生障碍性贫血属此种类型.依骨髓改变和临床过程不同可分为急性型和慢性型.急性型红髓有较广泛的病变。【骨髓象】增生减低或重度减低,粒红两系均减少,分别以成熟粒细胞和晚幼红细胞为主,成熟红细胞形态无明显改变.淋巴细胞明显增多.浆细胞、网状细胞、组织嗜碱细胞等非造血细胞增加.巨核细胞明显减少.髓粒网架空虚,造血细胞少见,含有较多纤维和非造血细胞。【血象】为正细胞性贫血.白细胞及中性粒细胞减少,淋巴细胞相对增加.血小板减少,网织红细胞绝对值明显降低。慢性型可因穿刺部位不同骨髓象差别较大,从增生减低到增生良好.前者似急性型,但无非造血细胞增多;增生良好者,晚幼红常增多,其核不规则呈分叶状,骨髓涂片油滴较多,非造血细胞和脂肪细胞增多,但巨核细胞减少,以资与增生性贫血相鉴别。三、巨幼红细胞性贫血（MegA）
巨幼红细胞性贫血是某些原因引起维生素B12或叶酸缺乏使DNA合成障碍所引起的一组贫血.包括恶性贫血、营养性巨幼红细胞性贫血,以及因妊娠、胃癌、胃切除或小肠吸收不良等引起的巨幼细胞性贫血。【骨髓象】增生活跃或明显活跃,幼红细胞增多,出现巨幼红细胞,其特点:胞体大、浆量多、核染色质疏松网状、核浆发育不平衡―幼核老浆,此类细胞常>0.10.粒细胞相对减少,可见巨晚幼和杆状核粒细胞,并出现核右移.粒/红比值降低.巨核细胞大致正常,但可呈巨型变或核分叶等.成熟红细胞大小不等,易见巨红细胞,可见Howell-Jolly's小体、点彩红细胞等。【血象】红细胞和血红蛋白均减少,以红细胞减少更明显,为大细胞性贫血.成熟红细胞有异形,可见多嗜性和点彩红细胞、Howell-Jolly氏小体等.白细胞和血小板正常或减少,可见核右移现象.网织红细胞正常或稍高。骨髓中典型的巨幼红细胞生成是诊断巨幼红细胞贫血的主要依据.为避免药物对细胞形态的影响,最好在检查骨髓象前不用维生素B12或叶酸等药物.为鉴别叶酸抑或维生素B12缺乏的巨幼红细胞性贫血,必须进行血清维生素B12、叶酸和红细胞叶酸等特殊检查。实验四十五、白血病
白血病是造血系统的一类恶性疾病,骨髓或其它造血组织中某种白细胞异常增生并广泛浸润,引起血液学质和量的改变,产生相应的临床表现。一、急性白血病（AL）
【骨髓象】增生极度活跃或明显活跃,以原始和幼稚白细胞为主,原始细胞>3.0.幼红细胞减少,粒/红比值显著升高（红白血病除外）.巨核细胞显著减少或消失,血小板减少。【血象】红细胞和血红蛋白常呈中、重度减少,为正细胞正色素性贫血.白细胞数不定,多数呈轻、中度增高,常12μm）为主,有时大小不等.核形不规则,染色质疏松而不一致,胞质常较多,有些细胞深染。第三型（L3）原始和幼稚淋巴细胞以大细胞为主,大小较一致.核形较规则,染色质均匀细点状.胞质较多,深蓝色,空泡多明显,呈蜂窝状。急性淋巴细胞白血病各亚型的诊断主要根据光学显微镜形态特点,L1与L2型主要按细胞大小,参照胞核与胞质而区分.细胞大小以直径12μm为界,≤12μm者为小细胞,>12μm者为大细胞.L1型以小原、幼稚淋巴细胞为主,L2型以大原、幼稚淋巴细胞为主.一般规定大原淋巴细胞≤0.25时为L1型,大原、幼稚淋巴细胞>0.25时为L2型.此外,在诊断急性淋巴细胞白血病时,还可用细胞化学染色或单克隆抗体与急性非淋巴细胞白血病鉴别。利用对淋巴细胞系细胞表面抗原有高度特异的单克隆抗体检测,可准确地鉴别ALL细胞的来源和阶段,从而对ALL进行免疫学分型.ALL的免疫学分型一般分为T-ALL、B-ALL、前B-ALL、Null-ALL、C-ALL五种免疫学类型.免疫学分型与形态学分型无相关性,但对指导治疗和估计预后更具有实用价值,其中C-ALL、前B-ALL预后最好,Null-ALL、T-ALL次之,B-ALL预后最差。随着细胞遗传学的发展,特别是高分辨分带技术以及探针的应用,对ALL除常规的形态学（包括细胞化学）与免疫学分型外,还应进行细胞遗传学-免疫学-形态学检查,即MIC分型,对AL的诊疗更有价值,代表了目前AL诊断的最新趋势。（二）急性非淋巴细胞白血病（ANLL）
（1）原粒细胞白血病未分化型（M1）:骨髓中原粒细胞（I+II型）≥0.90（非红系）,早幼粒细胞很少,中性中幼粒细胞以下阶段不见或罕见.（I型-典型原粒细胞,胞浆中无颗粒,II型-有原粒细胞的特征,胞浆量少,有少量细小的颗粒）。（2）原粒细胞