尤文肉瘤细胞总RNA修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定

作者：王剑，桑宏勋，王臻，郭征xdw中国学习动力网【关键词】树突细胞；肉瘤,Ewing；总RNA；逆转录聚合酶链反应；癌症疫苗xdw中国学习动力网【Abstract】　AIM:ToinvestigateRNAexpressionofdendriticcells（DC）pulsedwithtotolRNAfromEwingsarcomacells.METHODS:DCwasgeneratedfromtheperipheralbloodmononuclearcells（PBMC）ofEwingsarcomapatients.SurfacemarkersofmaturedDCswasdetectedbyflowcytometer（FCM）.TotalRNAwasisolatedfromEwingsarcomabyTrizol.DCweretransfectedwithtotaltumorcellRNA.TheexpressionofDCtansfectedwithtotalRNAwasmeasuredbyRTPCRmethod.RESULTS:SurfacemarkersofDCpulsedwithtotalRNAchangedapparently.CD40increasedfrom32.24%to72.32%.CD83increasedfrom17.39%to30.97%,whilemonocyteCD14declinedfrom26.37%to10.46%.ThisindicatedthesignificantreinforcementofantigenpresentationofDC.RTPCRshowedthespecificsequenceEWSFLI1ofEwingsarcomacanbecombinedwiththeprimerspecificallyatthebesttemperatureof54℃.CONCLUSION:DCpulsedwithtotalRNAofEwingsarcomacellscanpresenttumorspecificantigenandexpressitscharacteristicsequenceEWSFLI1specifically.xdw中国学习动力网【Keywords】　dendriticcells;sarcoma,Ewings;totalRNA;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;cancervaccinesxdw中国学习动力网【摘要】　目的：探讨树突状细胞（DC）经尤文肉瘤细胞总RNA加载后的体外RNA表达情况.方法：采用分离尤文肉瘤患者外周血单核细胞体外诱导DC,用流式细胞仪检测DC成熟后的表面标志，Trizol法提取患者尤文肉瘤组织总RNA,用总RNA转染DC，用RTPCR方法检测肿瘤总RNA加载的DC的表达.结果：经尤文肉瘤总RNA加载的DC表面标记发生明显变化，DC的特异性表面标志如CD40由32.24%增高至72.32%,CD83由17.39%增高至30.97%,而代表单核细胞的CD14则由26.37%下降至10.46%，标志其抗原呈递功能显著增强.RTPCR测定显示尤文肉瘤中的特异性序列EWSFLI1可以和引物特异性结合，并且最佳结合温度为54℃.结论：尤文肉瘤细胞总ＲＮＡ转染的DC可以呈递肿瘤特异性抗原，并特异性的表达其特有序列EWSFLI1.xdw中国学习动力网【关键词】　树突细胞；肉瘤，Ewing；总RNA；逆转录聚合酶链反应；癌症疫苗xdw中国学习动力网0引言xdw中国学习动力网细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicＴlymphocytes,CTL）能够介导特异性免疫应答,引导特异性肿瘤细胞杀伤效应.CTL的特异性免疫应答依赖于肿瘤抗原的存在,肿瘤抗原被抗原呈递细胞（antigenpresentingcell,APC）识别吞噬后,在抗原递呈细胞内加工处理形成特定的多肽片段,与MHCＩ类分子完全匹配后递呈到细胞表面,被相应Ｔ细胞受体（Tcellreceptor,TCR）识别,形成肿瘤抗原多肽MHCTCR复合物,在协同刺激因子的共同作用下,激活特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞,产生免疫反应、清除肿瘤细胞［1］.树突状细胞（dendriticcells,DC）是体内最重要的专职抗原递呈细胞［2］,可由骨髓干细胞、外周血干细胞及外周血单个核细胞在细胞因子作用下诱导扩增.95%的尤文肉瘤家族具有特异的染色体异位,从而形成的EWSFLI1融合基因是尤文肉瘤家族发生、进展的主要原因［3］.本研究从尤文肉瘤患者外周血中分离单个核细胞在IL4和GMCSF诱导下分化扩增DC,从患者尤文肉瘤组织中提取肿瘤总RNA加载DC,并对经总RNA加载后的DC进行鉴定，确定经肿瘤RNA加载的DC持续表达相应特异性肿瘤抗原,为DC在尤文肉瘤生物学免疫治疗中的临床应用提供实验依据.