涎腺腺样囊性癌转移细胞株的Notch基因表达

【摘要】目的筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的候选基因,并对其进行初步验证。方法限制片段差异显示PCR技术（RFDD-PCR）构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株（ACC-M、ACC-2）基因表达谱,生物信息学分析两个表达谱的Notch基因,半定量RT-PCR技术对两细胞株的Notch基因差异表达进行验证。结果用RFDD-PCR方法成功构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株（ACC-M、ACC-2）的表达谱,共获得5420个基因片段,其中包含3个Notch基因。半定量RT-PCR证实Notch2、Notch4在ACC-M的表达高于ACC-2,Notch1在两表达谱未见表达,半定量RT-PCR发现其在ACC-M的表达高于ACC-2。Notch3在两个细胞株表达的差别无统计学意义。结论Notch1、Notch2、Notch4可能与涎腺腺样囊性癌的发生、发展、转移有关。

【关键词】癌,腺样囊性;涎腺肿瘤;基因表达谱;逆转录聚合酶链反应;基因

ABSTRACT:ObjectiveToscreencandidategenesrelatedtocancerometastasisandadenoidcysticcarcinoma.MethodsRestrictionfragmentsdifferentialdisplayPCR（RFDD-PCR）wasusedtosetupgeneexpressionprofilesofadenoidcysticcarcinomacelllines-ACC-MandACC-2withhighandlowmetastasispotentialrespectively.Candidategeneswerescreenedthroughbioinformaticsanalysis.Theexpressionof4genesofNotchfamilywasassessedbysemi-quantitativeRT-PCR.ResultsTwogeneexpressionprofilesincluding5420genefragmentswereconstructed,3genesofNotchfamilywereobservedinthesetwocelllines.Semi-quantitativeRT-PCRidentifiedthat3geneofNotchwereNotch1,Notch2,andNotch4.ConclusionNotch1,Notch2,Notch4mayberelatedtocarcinogenesisandmetastasisofadenoidcysticcarcinoma.

KEYWORDS:carcinoma,adenoidcystic;salivaryglandneoplasms;geneexpressionprofiling;reversetranscriptasepolymerasechinareaction;genes

恶性肿瘤的浸润、转移是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程,也是恶性肿瘤患者主要致死原因。近年来研究发现,Notch基因改变与肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病、心血管病变等多种疾病的发生发展有密切关系。笔者从基因组的整体水平,观察Notch基因在涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株间mRNA表达的差异,为临床寻找更为敏感的转移相关指标提供参考。

1材料和方法

1.1.1细胞与试剂人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株（ACC-M）和低转移细胞株（ACC-2）由上海第九人民医院口外肿瘤实验室惠赠。Trizol试剂（美国Invitrogen公司）;第2代差异显示试剂盒/DISPLAYPROFILETMKits（美国Q-biogene公司）;Cy5荧光标记试剂盒（英国AmershamBiosciences公司）;Rnase抑制剂、逆转录酶（美国Promaga公司）;TaqDNA聚合酶、DL-2000DNAMarker［中国宝生物工程（大连）有限公司］;Notch等引物（上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司合成）。

1.1.2主要仪器紫外可见分光光度计（美国Bio-Rad公司）;MastercyclerGradient5331PCR仪（德国Eppendorf公司）;Typhoon9200荧光成像系统（英国AmershamBiosciences公司）;高压垂直电泳系统（美国Bio-Rad公司）;GeneSnap凝胶成像系统（英国SynGene公司）。

1.1.3生物信息学工具http://www.Qbio-gene.com/displayfit/数据库;GeneBank数据库;IMAGETOOL软件;Imagequant软件（AmershamBiosciences,v2003.02）;GeneTools软件（SynGene,Version3.00.22）;SAS软件等。

1.2.1表达谱构建Trizol试剂提取ACC-2、ACC-M的总RNA;根据两样品浓度不同取相应体积的总RNA（相当于1μg）,以随机锚定引物5’T25V合成cDNA;利用TaqI限制性内切酶位点一般位于编码区外的特性,将两样品cDNA用TaqI限制性内切酶进行消化,与两种特殊设计的接头混合相连;以64种差异显示引物分别对2种细胞株的转录组片段进行扩增;引物的特殊设计可以使扩增产物覆盖所有转录组片段,引物以Cy5荧光标记;采用6%尿素变性聚丙烯酰胺电泳分离、显示各转录组片段,在荧光成像系统上扫描凝胶,获得表达谱电泳图像［1］。

1.2.2表达谱生物信息学分析图像分析软件测量出所有片段在凝胶上的迁移距离。SAS统计软件进行曲线拟合,找出最佳拟合曲线,计算各片段bp值。以片断大小和所在“表达窗”作参数,按2%容许误差从数据库（Qbio-geneInc.&MPBiomedicalsInc公司提供）确定其所对应的基因,每个片段数据均与NCBIGeneBank直接链接。