作者：卢焱叶萍瞿振兴
单位：第二军医大学长海医院卢焱叶萍；药学院瞿振兴
关键词：气相色谱法；细菌，厌氧；细菌学技术
中华医学杂志920104
摘要用气相色谱法（GC）内标定量，测定74例外科感染标本中的短链子脂肪酸酸来检测厌氧菌感染，并与传统的细菌学方法作对照。结果：当标本中检出五种挥发性脂肪酸（丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸）中至少一种含量≥0.1µmol/ml和/或丁二酸含量≥0.3µmol/ml，可论断有厌氧菌感染。标本中丁酸含量≥3.5µmol/ml时，结合直接涂片、革兰染色和镜检，可以推测为梭杆菌的感染。标本中检出丁二酸≥0.3µmol/ml是脆弱类杆菌感染的特征。GC法快速、简便、重复性好，但仍存在“杂质”干扰色谱图和混合感染时的重叠峰等问题，有待进一步完善。
厌氧菌是人类内源性菌群的重要组成部分，在全身和局部感染性疾病中占很重要的地位[1]。厌氧菌感染发病率高，如未得到及时治疗，病死率也较高。传统的细菌学方法仍是迄今为止诊断厌氧菌感染的最常用方法，由于操作繁杂操作繁杂和费时（需3~7天出结果[2]），所以在一定程度上影响预防和治疗。60年代Abel等[3]将气相色谱法（GC）用于鉴定。GC具有快速、高效等特点，可弥补传统细菌学方法的不足，70年代GC已用于鉴定多种厌氧菌[4]。从1989年10月至1990年9月，我们进行了用GC内标定量测定感染标本中短链脂肪酸（SCFA）以论断厌氧菌感染的研究，报告如下。
材料与方法
一、标本
取自74例外科感染性疾病患者。用无菌方法抽取脓液或感染性分泌物，采标本时注意隔绝空气。每例标本分为3份：第一份作直接涂片、革兰（G）染色、镜检和需氧菌（含兼性厌氧菌）培养；第二份注入经过预还原处理的无菌小瓶中立即送实验室作厌氧菌培养；第三份不少于1ml，用50%硫酸（V/V）酸化至pH2.0，混匀后以2000r/min离心3分钟，取上清液加入清洁干燥试管，贮存于-20ºC，直至做GC分析。
二、细菌学方法
需氧菌的培养、分离和鉴定按常规方法[5]进行。厌氧菌的培养，分离和鉴定是在Hirasawa
ANX-1和YQX-1厌氧手套箱内完成，严格按照UPI手册的方法将标本中厌氧菌鉴定至种或属。
三、气相色谱方法
1.内标定量检测标本中的SCFA：（1）挥发性脂肪酸（VFA）：1ml酸化标本上清液中加0.1ml己酸内标溶液（己酸浓度100µmol/ml），1ml乙醚，塞紧试管，混匀，2000r/min离心3分钟，取乙醚提取物1µl做GC分析。（2）非挥发性脂肪酸（NVFA）：1ml酸化标本上清液（如量少，分析守VFA后在40ºC下将乙醚挥发净，留下上清液继续做NVFA分析）中加0.1ml丙二酸内标溶液（丙二酸深度100µmol/ml），1ml甲醇，混合，塞紧试管，56ºC水浴30分钟，然后加入1ml蒸馏水，1ml氯仿，充分混合，2000r/min离心3分钟，取氯仿提物1µl做GC分析。
每份标本至少各分析2次，分别求得VFA和NVFA的色谱峰面积平均值。
2.标准混凝土合酸溶液的配制和GC定量分析方法：（1）VFA标准溶液：准确量取适量色标乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸，混合后加一定量蒸馏水，使最终浓度各为100µmol/ml，用蒸馏水将溶液准确稀释至0.5~20µmol/ml，每一浓度溶液取1ml，加己酸内标深液0.1ml，酸化和提取后做GC分析（方法同前）。（2）NVFA标准溶液：准确量取适量乳酸、相二酸混合溶解后加蒸馏水使最终浓度各为100µmol/ml，用蒸馏水将深液准确稀释至0.5~50µmol/ml，每一浓度溶液取1ml，加丙二酸内标溶液0.1ml，酸化、甲酯化和提取后做GC分析（方法同前）。
标准混合酸溶液至少分别做3次GC分析，求得色谱峰面积的平均值。
3.气相色谱工作条件：一台ShimadzuGC-5A气相色谱仪、色谱柱为长3m，内径3mm玻璃术，分析VFA时担体为3%FFAP/PoropakQs（80~100目酸洗，Shimadzu公司），柱温82ºC，检测器为FID，注射口和检测器温度均为250ºC，载气为N2和H2各40ml/min，空气700ml/min。选用CDMC-1C色谱数据处理机处理GC分析所得数据。
本研究用ATCC25285（脆弱类杆菌）ATCC29741（多形类杆菌）和ATCC25285（脆弱类杆菌）ATCC29741（多形类杆菌）和ATCC13124（产产荚膜梭菌）作为质控菌株。
结果
74例外科感染的类型见表1。分离出的需氧（含兼性厌氧）菌以大肠埃希菌最多，占47.5%；厌氧菌以脆弱类杆菌最多见，占30.6%。
标准混合酸溶液GC图谱及保留时间见图1。由于乙酸与溶剂（乙醚）的色谱峰重叠，无法准确定量，本研究中略去不计。图2显示随着浓度的增加，标准酸与内标色谱峰面积之比（A/As）加大，二者有良好线性关系，用作图法或计算可求出标本中SCFA含量。
表174例外科感染性疾病的分类感染部位
例数
感染类型（例数）
无菌
需氧菌*
厌氧菌
混合性
颈部脓肿
1
0
1
0
0
乳房脓肿
2
0
2
0
0
胃穿孔腹膜炎
2
1
1
0
0
膈下脓肿2
1
1
0
0
急性化脓性
胆管炎9
0
3
0
6
急性化脓性阑尾炎
52
0
0
4
48
肝脓肿
1
0
1
0
0
结肠癌穿孔腹膜炎
2
0
0
0
2
肛旁脓肿
3
0
1
0
2
合计
74
2
10
4
58
*包括兼恬厌氧菌
VFA溶液（5µm/ml）NVFA溶液（10µm/ml）
P丙酸，IB：异丁酸，B：丁酸，IV：异戊酸，V：戊酸，C：己酸（内标），L：乳酸：S：丁二酸，M：丙二酸（内标）
图1标准混合SCFA溶液的GC图谱
A：SCFA的色谱峰面积
As：内标物的色谱峰面积（内标浓度10µmol/ml）
S、IV、V、IB、B、P、L含义见图1说明
图2A/As与SCFA含量的关系
从表2可见，标本中检出SCFA与厌氧菌感染密切相关（P<0.001）。标本中各种SCFA与厌氧菌感染的关系如表3所示。进一步的分析表明，标本中检出丁酸与厌氧菌感染密切相关。以丁酸含量≥0.1µmol/ml为阳性，厌氧菌（+）的62份标本中35份丁酸阳性，而厌氧菌（-）的12份标本中无一份丁酸含量≥3.5µmol/ml时，都检出梭杆菌属，其丁酸平均含量为11.36±8.99µmol/ml，多于其它厌氧菌感染的标本（丁酸平均含量0.77±0.78µmol/ml）。3例产气荚膜梭菌感染的标本中都检出多量的丁酸（11.3、12.8和14.1µmol/ml）。标本中异戊酸含量≥0.15µmol/ml时均分离出脆弱类杆菌。在爽灵敏标本（66/74）中可检出多量乳酸，表明乳酸没有特异性诊断价值。标本中西二酸含量≥0.3µmol/ml与厌氧菌感染，尤其与脆弱类杆菌感染密切相关以丁二酸含量≥0.3µmol/ml为阳性，厌氧菌（+）62份标本中34份丁二酸阳性，而厌氧菌（-）的12份标本中仅1丁二酸阳性（P<0.001）；丁二酸阳性的35份标本中33份检出脆弱类杆菌（余2份中分别分离出侵蚀类杆菌和副
溶血弧菌），而丁二酸阴性的39份标本中则仅4份检出脆弱类杆菌（均为吉氏类杆菌）（P<0.001）。表274份标本中SCFA的检出与感染类型的关系（份数）细菌培养结果
SCFA（+）**
SCFA（-）
合计
厌氧菌
53
9Δ
62
无菌和需氧菌*
4
8
12
合计
57
17
74
**含量性厌氧菌
**丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的至少一种≥0.1µmol/ml和/或丁二酸≥0.3µlmol/ml，P<0.001
Δ5例检出厌氧链球菌，2例有腐败类杆菌，2例分离出G+厌氧芽胞梭菌表374份酝酿中不同SCFA与厌氧菌感染的关系（份数）SCFA
厌氧菌（+）
（n=62）
厌氧菌（-）
（n=12）
挥发性
丙酸
42
3
异丁酸
9
0
丁酸
35
0
异戊酸
10
0
戊酸
1
0
非挥发性
乳酸
58
8
丁二酸
34
1
讨论
特征性代谢产物是厌氧菌分类的重要依据[2，6]。采用GC法直接定量检测标本中的SCFA以快速诊断厌氧菌感染是分析化学方法在临床微生物领域的应用。本研究的结果表明，常见的五种挥发性脂肪酸，即丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和丁二酸对于诊断厌氧菌感染有重大价值。这证实了以往的报道[8，9]。而定量检测标本中的SCFA较定性的方法有更大的意义。标本中上述五种挥发酸的至少一种含量≥0.1µmol/ml和/或丁二酸≥0.3µmol/ml是厌氧菌感染的证据。丁酸是厌氧菌的特征性产物，当标本中检出大量丁酸，尤其丁酸含量≥0.35µmol/ml是梭杆菌属和产气荚膜梭菌感染的特征。实际工作中二者只需通过简单的G染色和镜检即可鉴别。所以说GC与标本直接涂片、G染色和镜检结合应用可提高诊断的准确性。我们还发现标本中异戊酸含量≥0.15µmol/ml与脆弱类杆菌感染有关。GC检测NVFA时必须先将标本甲酯化。目前还没有一种标准化的方法。本研究中采用的方法较简单，甲酯产生量也较多。尽管有的国外学者对是否有必要检测NVFA仍有疑议[10]，但本研究的结果表明，标本中检出丁二酸与厌氧菌感染有关，丁二酸≥0.3µmol/ml是脆弱类杆菌感染的重要特征。本研究中未检出G+厌氧球菌、链球菌和一些G+厌氧芽胞梭菌的特征性产物，这有待于今后进一步改进方法提高灵敏度和适用性。
用GC定量检测标本中的SCFA以诊断常见的厌氧菌感染，能在2小时内获得结果，与直接涂片、G染色和镜检结合能将一些常见厌氧菌鉴定至属、群或种。但迄今为止，国内外仍未解决用GC直接检标本时“杂质”干扰色谱图和混合性感染标本中多种厌氧菌的特性色谱峰相互重叠，从而影响结果判断的问题。改进设备和工作条件以提高检测灵敏度；将标本经短时间孵育后检测培养物中行征性产物以及建立厌氧菌的标准色谱图或“指纹图”，用计算机进行比较，根据标本中厌氧菌的特征性产物从而直接对其鉴定或分类，这将成为解决上述问题的方法，需进一步探讨。
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（1991年3月6日收稿同年8月17日修回（卢焱叶萍瞿振兴）
