阵发性睡眠性血红
蛋白尿症、再生障碍性
贫血和
骨髓增生异常综合征患者三种CPI-锚蛋白的表达及临床意义hc360慧聪网医疗器械行业频道2004-05-0813:22:06
[摘要]目的观察阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）、
再生障碍性贫血（AA，再障）和骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血粒细胞三种CPI-锚蛋白（CPI-AP）CD55、CD59和CD87的表达情况，测定血清可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（su-PAR）水平，探讨它们的临床意义。方法PNH组22例，其中4例合并血栓性疾病，5例为AA-PNH综合征；再障组30例，其中重型再障9例，慢性再障21例；MDSRA组27例；健康对照组20名。以流式细胞术检测外周血粒细胞CD55、CD59和CD87的表达，ELISA法检测血清su-PAR。结果20名健康人外周血粒细胞三种CPI-AP阳性比例均大于90％，Cd59稳定性最好。PNH组三种CPI-AP的阳性比例均显著下降，血清su-PAR水平显著升高，与正常对照组比较，均有显著性差异。其中，频发组较不发作组三种GPI-AP的表达率均明显降低，CD55的差异有显著性。PNH患者中，血栓阳性组较血栓阴性组CD87的表达率降低有显著性，血清su-PAR水平显著升高。再障组粒细胞CD87表达率较正常对照组显著降低。5例AA-PNH综合征患者三种GPI-AP的表达率与PNH患者比较，均无显著性差异；与再障患者比较，均显著降低。MDS-RA组三种CPI-AP的表达率较健康对照组均无显著性差异。结论以流式细胞术检测外周血粒细胞CD55、CD59和CD87以及检测血清su-PAR有助于PNH、再障和MDS-RA的诊断与鉴别，su-PAR亦有助于监测PNH患者
血栓形成的病情变化。
[关键词]血红蛋白尿，阵发性；贫血，再生障碍性；骨髓增生异常综合征；膜蛋白质类
糖化磷脂酰肌醇锚连蛋白（GPI-AP）通过糖化磷脂酰肌醇（GPI）锚连到细胞表面[1]，其中衰变加速因子（DAF，CD55）和反应性溶血膜抑制物（MIRL，CD59）参与调节补体介导的溶膜反应[2]，尿激酶型纤溶酶原激活物受体（u-PAR，CD87）主要调节局部纤溶活性[3]。GPI缺陷使CD55、CD59和CD87无法固定于细胞膜上，血细胞易受补体系统的作用而溶破，局部纤溶活性降低，利于血栓形成。阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）、再生障碍性贫血（AA，再障）和骨髓增生异常综合征（MDS）均属于干细胞缺陷性疾病，常有不少难以判断的病例。我们利用流式细胞术检测了患者外周血粒细胞上CD55、CD59和CD87的表达，探讨它们在疾病发生、发展中的临床意义。
病例和方法
1研究对象PNH组22例，男14例，女8例，年龄19-65岁，中位年龄31岁，病程16d-16年，其中4例合并血栓性疾病，5例为AA-PNH综合征。再障组30例，男17例，女13例，年龄12-67岁，中位年龄34岁，病程6个月-14年，其中重型再障（SAA）9例，慢性再障（CAA）21例。MDS-RA组27例，男19例，女8例，年龄20-71岁，中位年龄44岁，病程1个月-7年。诊断均符合文献[4]标准，均为山东大学齐鲁医院住院及门诊患者。正常对照组20名，男11名，女9名，年龄19-35岁，均为健康志愿者。
2试剂和设备荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记鼠抗人CD55抗体和荧光素藻红蛋白（PK）标记鼠抗人CD59抗体为PharMingen公司产品；PE标记鼠抗人CD87抗体为BD公司产品；同型匹配的无关鼠IgG-FITC和IgG-PE为PharMingen公司产品；溶血素FACSLysingSolution为BD公司产品；可溶性u-PAR（su-PAR）ELISA检测试剂盒为R&D公司产品；流式细胞仪FACSVantage为BD公司产品；酶联免疫检测仪（Bio-RADModel450）为美国MicroplateReader公司产品。
3实验方法
3.1流式细胞术检测Cd55、CD59、CD87:抽取空腹外周静脉血1ml加肝素抗凝。分设实验管和对照管，每管加入约含1×106个粒细胞的肝素抗凝全血100μl。实验管各加入20μl荧光标记抗体，对照管加入相应鼠Ig-FITC或鼠Is-PK20μl，混匀，室温避光孵育30min。加入溶血素2ml裂解红细胞，静置10min，1000×g离心10min，PBS洗涤2次，弃上清，加入1mlPBS将细胞悬浮，待上机检测。流式细胞仪激光光源为氩离子激光器，激发波长为488nm。利用CellQuest软件进行资料采集和分析，用前向角散射对侧向角散射散点图区分血细胞群体，用门技术（gating）圈出欲分析的细胞群体。每份检测10000个细胞。通过荧光散点图和荧光直方图分析粒细胞上CD55、CD59、CD87的表达。
3.2ELISA法检测血清su-PAR：抽取空腹外周静脉血2ml自凝，1000×g离心15min，取血清-80℃保存待测。按su-PARELISA检测试剂盒说明书进行操作，以酶联免疫检测仪测定。
4统计学处理数据以均值±标准差表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用q检验。CD87阳性细胞百分率与su-PAR间采用相关分析，显著性检验采用t检验。
结果
120名正常人外周血粒细胞CD55、CD59、CD87。三种GPI-AP均呈单一阳性群体，阳性比例均大于90％，其中CD59的稳定性最好，CD55次之，CD87个体差异较大。
222例PNH患者外周血粒细胞CD55、CD59、CD87。三种GPI-AP的表达率与正常对照组相比，差异均有显著性（P均<0.01）。
将PNH患者按病情分为频发组、偶发组和不发作组，频发组和偶发组相比，粒细胞三种GPI-AP的表达率均有所降低，但无统计学意义（P>0.05）。频发组和不发作组相比，粒细胞CD55、CD59和CD87的表达率均明显降低，其中CD55的差异有显著性（P<0.05），CD59、CD87的差异无显著性（P均>0.05）；偶发组和不发作组相比，粒细胞三种GPI-AP的表达率均有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。
将PNH患者按有无血栓形成进行分组，血栓阳性组CD55和CD59的表达率较血栓阴性组降低，但差异均无显著性，血栓阳性组CD87的表达率显著降低，血清su-PAR水平明显升高，与血栓阴性组比较，差异有显著性（P均<0.05）。
将PNH患者按实验室检查情况进行分组，酸溶血试验阳性组与阴性组比较，三种GPI-AP的表达率均明显下降，差异有显著性（P均<0.05）；糖水试验和尿潜血试验阳性组与阴性组比较，三种GPI-AP的表达率差异均无显著性（P均>0.05）。
3CD87的表达率较正常对照组下降，差异有显著性（P<0.05）；与PNH组比较，三种GPI-AP的表达率差异均有显著性（P均<0.01）。SAA与PNH患者比较，三者均有显著性差异（P均<0.01）。
5例AA-PNH综合征患者外周血CD55+粒细胞为（18.2±27.4）％，CD59+粒细胞为（22.7±6.4）％，CD87+粒细胞为（7.3±5.3）％，与其他PNH患者比较，三种GPI-AP的表达率差异均无显著性（P均>0.05）。与再障患者比较，三种GPI-AP的表达率均有显著降低（P均<0.01）。
427例MDS-RA患者粒细胞CD55、CD59、CD87的表达率与正常对照组、再障组比较，差异均无显著性（P均>0.05）；与PNH组比较，差异均有显著性（P<0.01）。
5PNH组血清su-PAR水平[（2991.2±1817.7）ng／L]较健康对照组[（913.0±517.3）ng／L]显著升高（P<0.01），PNH血栓形成者su-PAR水平显著高于血栓阴性者。健康对照组血清su-PAR与u-PAR+CD87+粒细胞百分率无明显相关性（r=0.257，P>0.05）。PNH患者血清su-PAR与u-PAR+CD87+粒细胞百分率呈负相关（r=-0.701，P<0.05）。
再障、MDS-RA和正常对照者血清su-PAR水平相互间差异无显著性差异（P>0.05），与PNH患者比较，差异均有显著性（P<0.05）。
目前已发现GPI-AP有100多种，包括补体调节蛋白、受体类、酶类、黏附分子和其他功能尚未明确的蛋白，主要参与细胞与细胞、细胞与环境间的作用。细胞浆内的肌醇磷脂酶C和D可作用于GPI，使蛋白从细胞膜上脱落，如可溶性DAF、可溶性u-PAR等[5]。PIG-A基因突变，使GPI无法合成，导致蛋白不能通过GPI固定在膜上[2]。
已发现十余种GPI-AP缺乏可能与PNH异常红细胞对补体敏感性增高有关，其中以DAF和MIRL最为重要。DAF可加速补体C3转化酶的衰变，从而抑制补体C3的激活，MIRL通过与补体C8、C9结合，抑制膜攻击复合物的形成，二者缺乏后均易引起补体溶血[2]。u-PAR在血液中主要存在于中性粒细胞和单核细胞的膜表面，促进尿激酶型纤溶酶原激活物活化，使纤溶酶原活化为纤溶酶，发挥局部纤溶等多种作用[3]。若细胞表面缺乏u-PAR，可使局部纤溶机能降低，同时血浆中增高的可溶性u-PAR与细胞表面的受体竞争结合尿激酶，进一步加剧纤溶活性的不足，被认为是易于发生血栓的一个重要原因[5,6]。
再障、PNH和MDS都是干细胞缺陷性疾病，可互相转化或共存，临床上某些病例的鉴别是相当困难的。研究证实，再障患者若存在粒细胞或网织红细胞GPI-AP缺陷，提示PNH倾向[7]。综合国外的报道及我们以往研究的结果[8]，以流式细胞仪检测GPI-AP诊断PNH以粒细胞的特异性及敏感性最好。本研究结果显示，正常对照组中三种GPI-AP阳性粒细胞均呈单一阳性群体，其中以CD59稳定性最好，因此对正常人群的判别应以CD59为宜。
PNH组粒细胞CD55、CD9和CD87表达与正常对照组均有显著差异。分析三种GPI-AP表达率的个体差异，提示PIG-A基因突变造成GPI锚合成障碍对三种GPI-AP的影响不完全相同，但三种GPI-AP均可作为PNH的诊断指标。PNH组血清su-PAR的水平较健康对照组显著升高，亦可作为PNH的诊断指标，但其分布范围与正常对照组有重叠，对其诊断界限的判别还需进一步界定。
在本组的PNH患者中，频发组与不发作组相比，CD55的表达率差异有显著性，但还需积累较大样本，以确定其在预测病情方面的作用。曾有血栓组与无血栓组比较，前者CD87的表达率显著性降低，su-PAR水平显著升高，提示CD87与血栓形成关系密切，测定粒细胞CD87和血清su-PAR有助于监测血栓形成的倾向。酸溶血试验阳性组与阴性组比较，三种GPI-AP的表达率均有显著性差异；糖水试验和尿潜血试验阳性组与阴性组比较，三种GPI-AP的表达率均无显著性差异，表明酸溶血试验与GPI-AP间相关性较好。在本组22例PNH患者中，有4例酸溶血试验（-），5例糖水试验（-），8例Rouse试验（-），虽然最后确诊为PNH，但易漏诊，而这些患者三种GPI-AP表达率皆明显降低，显示以流式细胞术测定粒细胞CD55、CD59和CD87的表达率较上述三种诊断性试验敏感而特异。
30例再障患者粒细胞三种GPI-AP的表达率均有所降低，以CD87降低最为显著，特别是SAA组更为明显，部分再障患者可检测到PNH样异常血细胞，提示对于在再障患者中检测到PNH样异常细胞，检测CD87与CD55、CD59同样具有重要意义。在本研究中，有5例患者为AA-PNH综合征，其中4例由再障演变为PNH，1例由PNH演变为再障，此5例患者外周血粒细胞CD55、CD59、CD87的表达率与其他PNH患者比较差异均无显著性，与再障患者比较，差异均有显著性，提示AA-PNH综合征患者体内PNH异常细胞显著增多，与PNH相近，而与再障有明显区别。目前AA-PNH综合征的诊断仍以Ham试验阳性为主要依据，而用流式细胞术检测GPI-AP更加敏感和特异。鉴于再障和PNH的转化是一个渐进的过程，两者之间的判别值的确定尚无统一标准，因此，对此类患者应进行动态观察。
MDS虽同为获得性造血干细胞疾病，但其发病机制不同。本研究结果显示MDS患者粒细胞三种GPI-AP的表达率与正常对照组比较，差异无显著性，除1例外，粒细胞CD55-、CD59-和CD87-群体皆小于10％。鉴于有些低增生性MDS与再障的鉴别比较困难，此时检测粒细胞CD55、CD59或CD87的表达可能有所帮助。
PNH、再障和MDS的临床演变过程多种多样，难以用一种理论解释全部病例，演变可能是由于多种因素，有多种过程。以流式细胞术检测外周血粒细胞CD55、CD59和CD87的表达并检测血清su-PAR有助于PNH的诊断以及再障的转化，测定血清su-PAR亦有助于监测血栓形成的倾向。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备手术器械保健器材卫生材料信息来源：董孝媛徐从高孙国瑞
